3. 将细胞悬液在4℃，200g离心10min。离心过程中，准备3支小鼠CD3+T细胞纯化柱，按说明书的指导用1×纯化柱缓冲液洗3遍。弃洗脱液，在每支纯化柱下方放置一支15ml离心管。
4. 用3ml 1×纯化柱缓冲液和3ml HBSS洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜后，每支纯化柱中加入2ml细胞。室温孵育15min。
5. 用2ml 1×纯化柱缓冲液洗涤纯化柱4或5遍以洗脱T细胞。用血细胞计数器计数后，将细胞悬液在4℃，200g离心10min。
9. 将Midi MACS分离磁铁安装到MACS多用支架上，并将LD分选柱放到磁铁中，每次用3ml 4℃不含气体的MACS缓冲液冲洗分选柱共3次。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的无菌15ml离心管。
10. 离束后弃上清，将沉淀用108个细胞/ml的MACS缓冲液彻底混悬。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。用0.1-0.4ml MACS缓冲液冲洗滤网。
12. 用MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml，共3次。第一个3ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞(CD4+细胞)保存。
17. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到108个细胞/ml。每108个细胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。
21. 将一支LS分选柱放在Midi MACS分离磁铁上，用MACS缓冲液每次3ml洗3遍LS柱。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的15ml离心管。
25. 用MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml，共3次。第一个3ml应缓慢加入以免扰动分选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞(CD4+CD25-细胞)保存。
26. 将分选柱从磁铁上取下。在分离柱中加入5ml MACS缓冲液。将活塞塞进分离柱并洗脱阳性细胞(CD4+CD25+细胞)。
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