毕氏酵母感受态细胞制备及

　　50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装)

　　将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的，按6样品/组进行);

　　取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8;

　　重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，

　　将约50ug线ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大率;

　　灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10%甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。

　　从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。

　　4) 电击后，马上在电击杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中;

　　5) 取30℃烘至表面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板