FITC标记抗体-Marsshall氏法

　　抗体球蛋白溶液、0.5mol/L pH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶(25—50ml)、冰及冰槽(或1000ml烧杯)、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻璃棒、棉线mol/L PBS等。

　　1.抗体的准备。量取适量已知浓度的球蛋白溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最终球蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌速度适当，即以不起泡沫为宜搅拌5—10min;

　　2.荧光素的准备。根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素的比例，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末;

　　3.结合(或称标记)。将称取的荧光色素缓慢加入到球蛋白溶液中，并不停地搅拌，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻璃棒上，在大约5—10min内加完。然后继续搅拌12—18h。因荧光素与球蛋白结合期间要求必须保持蛋白溶液于4℃左右，所以需要即使地添冰或去水。亦可将结合装置安放在4℃冰箱或冰库中;

　　4.透析。荧光素与球蛋白结合完毕后，将球蛋白的溶液以2500r/min离心20min，除去其中少量的沉淀物后，装入透析袋中再置于烧杯中，在0—4℃下用pH8.0的缓冲盐溶液透析过夜;

　　5.过柱。取透析过夜的标记物，过葡萄糖凝胶G-25或G-50柱，分离出游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。