正乳腺上皮细胞培养

　　P.S：血清和储存备用的胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、胰酶和胰蛋白酶应在-20℃条件下保存。

　　1. 于产后2-7d收集乳汁。用无菌水擦洗乳房，将乳汁挤入无菌容器。将收集的乳汁混合后，用RPMI1640稀释，以利于离心。

　　2. 将稀释的乳汁离心(600-1000g，20min)后，轻轻吸去上清。为了避免影响沉淀细胞，应留有少量液体。用含有5%FBS的RPMI1640洗细胞2-4次，直至上清不浑浊。

　　3. 用生长培养液混悬细胞，将50μl细胞悬液加入含6ml培养液的5cm培养皿中。在37℃，5%CO2条件下培养细胞。

　　4. 3-5d后换液，以后每周换液2次，6-8d出现克隆。开始时，有巨噬细胞混杂生长，起着饲养细胞的作用。克隆增多后巨噬细胞逐渐消失。

　　5. 传代培养。细胞长满底壁80%-85%时，可传代。每个5cm培养皿1.5ml加入TEGPED，在37℃条件下用，孵育细胞5-15min。然后，混悬细胞。

　　6. 离心(100g，5min)后，用培养液混悬细胞，将细胞悬液稀释3倍。将细胞悬液接种到培养皿或培养瓶中，每3个培养皿或每1个培养瓶2ml。