5. EGF：100ugEGF溶于1ml无菌的UPW中。按100ul分装，在-20℃条件下储存。用10ml的含有血清的培养液配制100ug/mlEGF工作液，按100ul分装，在4℃储存。使用时，用含有血清的培养液稀释(1：100)成最终浓度(10ng/ml)
7. 氢化可的松：将1mg氢化可的松溶解于1ml 50%乙醇(v/v，用蒸馏水配制)。然后，按100ul分装，在-20℃储存。最终浓度为0.5ug/ml
(1) 准备大量的3T3细胞，按1.5×104个/cm2的细胞密度将3T3细胞接种入培养瓶内，用含有10%小牛血清的DMEM培养。24h后换液，每2-3d换液1次，4-5d传代。使用的细胞不超过20代。
(2) 为了避免轻度污染，将一瓶生长较好的细胞用无抗生素培养液培养。然后，在每代用这些细胞接种于该周所需要饲养细胞的培养瓶中。
(3) 通过60Gy X射线Co照射使饲养细胞灭活。被照射的3T3细胞在4℃条件下可存放3-4d。
(4) 在无照射源的条件下，用丝裂菌素C灭活饲养细胞。在37℃条件下，用400ug/ml丝裂菌素C处理单层3T3细胞1h。用胰蛋白酶消化丝裂菌素C处理过的细胞，混悬细胞，用含有血清的培养液洗细胞2次。然后，用完全培养液混悬细胞，调整细胞密度。
2. 从转运培养液中取出子宫颈部皮肤组织块，用5ml含有50ug/ml硫酸庆大霉素和5ug/ml两性霉素的无菌PBSA冲洗2-3次。将组织块放入培养皿，表皮面朝下，用一次性手术刀剥除肌肉和真皮，保留薄而不透明的表皮片，用眼科剪将表皮片剪碎至1cm3大小。
3. 将剪碎的组织块转入无菌三角瓶内，加入15ml预先在37℃条件下预热的胰蛋白酶-EDTA液，将三角瓶移入恒温水浴振荡器内，37℃水浴中振荡消化45min。在室温条件下，将细胞悬液放置2-3min。取出细胞悬液，用不锈钢或塑料滤网滤入50ml离心管。然后加入10ml完全培养液。
4. 加入15ml预热的胰蛋白酶-EDTA液含有表皮小块的器皿，重复消化、过滤操作步骤2-3次。收集细胞悬液，以1000r/min，离心5min，吸去上清液，加入10ml完全培养液，充分混悬细胞。用血细胞计数板计数细胞，然后用台盼蓝拒染法估计细胞活力。
5. 用KCM稀释细胞悬液，将2×104个/cm2表皮细胞与1×105个/cm2致命灭活的3T3细胞同时放入培养皿。60mm培养皿，接种1×105个/cm2个表皮细胞和5×105个/cm2个被照射的3T3细胞。
6. 在37℃、5% CO2条件下培养细胞。培养72h后，用添加10ng/ml EGF的培养液换液。在显微镜下检查细胞，确定加入足够的饲养细胞。如有必要，再加入饲养细胞。每周换液2次。8-12d，在显微镜下可见到角质形成细胞克隆。14-16d，下见到角质形成细胞克隆，此时应进行传代。
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