细胞损伤模型

　　大鼠4%戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5%小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心(500 r·min-1，1 min，4℃)弃上清，同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液(内含10%小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素)制成1×109个·L-1肝细胞悬液。分离的肝细胞经0.6%台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90%，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99%为肝实质细胞。

　　将上述肝细胞悬液分别加入24孔(每孔1 ml)和96孔(每孔0.1 ml)培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养。12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。

　　肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔(1～16mmol·L-1)，以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1%(体积分数)〕，作用不同时间(1～12 h)后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性;同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备CCl4肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

　　同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2(0.2～3.2 mmol·L-1)，作用不同时间(0.5～4 h)后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量;同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备H2O2肝细胞损伤的量效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。

　　(3)肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)活性的测定先制备GSH标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入0.2% Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 min后，离心(2 500 r·min-1，10 min)，取上清液(肝细胞样品)0.4 ml，另设样品空白管，非酶反应管和试剂空白管，加入各种试剂。混匀后立即计时，静置12 min后，以样品空白管调零点，于423 nm波长处读得吸光度(A)值。在GSH标准曲线上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位是在37℃，pH6.5条件下，每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位。计算公式为：GSHpx活力单位=([GSH]非酶管-[GSH]样品管-[GSH]试剂空白管)/3。结果以U·(106 cell)-1表示。

　　(4) 肝细胞丙二醛(MDA)含量的测定先制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清，加入生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心(2 500 r·min-1，10 min)，弃上清，加15% TCA 2 ml，细胞并沉淀蛋白质，加入0.67% TBA 2 ml，于沸水浴中加热30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度，结果以 nmol·(106 cell)-1表示。

　　数据以±s表示，计量资料组间比较采用t检验。两变量间相互关系，采用直线相关和回归分析。

　　一、材料纯系SD雄性大鼠，体重180g～200 g，由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用酿酒总厂出品的56度红星二锅头。

　　二、方法将大鼠随机分成5组，饲养在23℃～25℃室内，、进水;根据大鼠体重，A、B、C、D组每日用56°红星二锅头白酒以10ml/1Kg分别灌胃 0、4周、8周和12周;E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周。大鼠通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本。

　　(1)肝功能：应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、球蛋白(Glb)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)等。

　　(2)氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。

　　(3)大鼠肝脏病理检查：大鼠处死后立即取出肝脏，称重后一部分以10%的福尔马林液固定作病理，作常规石蜡切块并HE染色，在光学显微镜下进行观察，用半定量法分别判定脂肪变性、及酒精性肝炎炎症活动度。

　　原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h(贴壁良好)后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳0.4M容积，37度90min，造成肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。(即熏蒸法)

　　肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并加入CCL4 8mM(事先用DMSO溶解，DMSO终浓度1%)，作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性，评价损伤程度。(常用方法)

　　肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继续培养12h，取培养液，进行下一步实验。

　　肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量。

　　肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反应肝细胞损伤程度。本模型可以更好的模拟缺氧损伤。

　　肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入TTA0.18mM，继续培养48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性升高，造成体外损伤肝细胞模型。

　　贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素70uL/mL，置37度，5%CO2培养此时上清LDH活性升高造成肝细胞损伤模型，造成体外肝细胞损伤模型。

　　分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液，继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT显著升高时，肝细胞造模成功。

　　取新生的wistar 大鼠脊髓,剪碎,0125 %胰蛋白酶消化1h ,用含血清的DMEM培养液终止胰蛋白酶的作用; 而后吹打成散在的单个细胞,进行细胞计数,按5 ×105 个Pcm2 密度进行接种。培养至第10天时加10mM Leu2methy12ester 除杀小胶质细胞。于16d 时,用塑料吸管头划刮培养皿,产生宽约1mm长约1. 5cm 的损伤带,对照组未划伤,每组共分为7 个时间点,分别是划伤后0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h。

　　用免疫组织化学染色的方法分别观察划伤组和对照组星形胶质细胞中GFAP 的表达,进行半定量图像分析。

　　从损伤后2h ～ 72h , 划伤组星形胶质细胞中GFAP 表达量与未划伤的星形胶质细胞GFAP 的表达量均有极显著性差异。

　　采用上述方法选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖T-BSS反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎，移入0.25%胰蛋白酶溶液中，37oC振荡消化30分钟，后加入血清数滴终止消化，用吸管轻轻吹打后，加入不含血清的DMEM培养液混匀，1000rpm，10min离心收集细胞，反复2次，后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞，过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液，计数后将约3×106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸的35mm的六孔培养板中，置37oC、5%CO2培养箱中培养。24小时后待细胞完全贴壁时，置换旧培养液，以后每隔2天更换一次培养液。培养至第六天时加入100uM的6-OHDA处理3小时后吸出。在相应备孔中加入完全DMEM培养液洗涤2遍，再加入完全DMEM培养液继续置5%CO2培养箱中培养24小时，采用与上述相同的方法做免疫细胞化学染色，计数TH阳性细胞，确立6-OHDA对体外培养的多已胺能神经元的损伤作用。

　　取出生1-2d的乳鼠，用麻醉剂处死。在D-hanks液中取大脑并分离海马组织，胰蛋白酶消化，获得细胞悬液，胎盘蓝染色进行死活细胞记数，将细胞以5×105/ml的密度接种于预先经L-多聚赖氨酸处理的96孔和24孔培养板,其中24孔板中预先放置有盖玻片。细胞维持在培养液中，置入5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，24h后全换液，接种当天为第一天,每3d半量更换培养液一次，培养第3天时加入阿糖胞苷,终浓度为10μmol/L,以神经胶质细胞的过度增殖,24h后更换全部培养液继续培养,第10天进行细胞造模，开始实验。

　　取出生后1-2 d乳鼠心尖部组织, 胰酶消化, 离心后用含20%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液, 过滤, 按差速贴壁分离法纯化心肌细胞, 以1×105 cells/cm2接种于24孔板, 每24 h更换培养液。贴壁生长2 d, 于实验前24 h更换为无血清DMEM培养基, 随机分组, 每组双平行孔, 重复4次操作。

　　首先将培养基用N2在密闭容器中平衡1 h以上制成无氧培养基, 将培养孔中含氧培养基吸出后加入无氧培养基, 随后将培养板置于含5% CO2-95% N2 (V/V)混合气体的密闭容器中(37℃)进行缺氧孵育10 h, 此为缺氧操作, 然后更换为与O2平衡的培养基, 放回培养箱, 复氧孵育1 h。A

　　抑郁等疾患的发生可能与过量GC对海马的选择性损伤有关，但机理不明，Heuser和Cosi等报道可能是由于高浓度GC导致神经营养因子表达水平降低造成的，而抗抑郁剂不仅使GC受体上调，HPA轴反馈恢复正常，而且使神经营养因子表达升高，达到治疗目的。PC12细胞株为大鼠嗜铬细胞克隆化细胞株，分化的PC12细胞有典型的神经细胞特征，其胞膜上GC受体表达丰富[6]。本文根据文献方法以高浓度皮质酮(corticosterone)模拟抑郁及焦虑症神经细胞损伤状态

　　嗜铬细胞瘤株PC12细胞。用含5%胎牛血清及5%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU.L-1,链霉素100mg.L-1pH7.4)调细胞密度为2x108L-1接种于预先用多聚赖氨酸(0.1g.L-1)处理过的96孔培养板，每孔10LL,放入CO2孵箱，培养3~4d,待细胞长满孔底后即可用于实验。参照文献方法，稍加修改，吸去细胞液换上含有相应浓度药物及0.2mmol.L-1皮质酮的无血清DMEM(对照组不含任何药品)，培养48h,吸去培养液，用D2Hanks液洗2遍，每孔加入含0.5g#L-1MTT的无血清DMEM培养4h后吸去培养液，每孔加入10%十二烷基硫酸钠100LL,待蓝色颗粒完全溶解(约12~16h)，用多孔扫描分光光度计测定标本在570nm波长处的吸光度(A570nm)值，用于定量反映活细胞数。