在甲醇酵母中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
TOP10F’做为菌种保存在-70℃条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。
重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的子。如对载体pPC19选用BgiⅡ线性化，后可得到Muts表型子;选用SaI或StuI线性化，后可得到Mut+表型子。为了防止载体质粒DNA的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理酶切后的质粒DNA，具体操作如下：
(3)灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10%甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。
(5)从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。
对于P.Pastoris的目前有4种方法：①锂盐法;②PEG法;③原生质球法;④电穿孔法。锂盐法和PEG法方法简便，但效率很低，每微克DNA只有几十个子或更低，一般不多用。原生质球法和电穿孔法率都较高，而且一般可得到高拷贝重组，其率都可达到105/μg。但原生质球法操作繁琐费时;电穿孔法简便、快速、高效，是理想的方法。
(4)电击后，马上在电击杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中;
(5)取30℃烘至表面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板;
(3)将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
(6)按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml;
(10)根据电仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击;
子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取子DNA，用外 源基因两侧引物扩增筛选。然而，这只限于少量子子。太多则工作量太大。对于大量子的筛选，可用原位点杂交进行。即把相同量的不同子点在NC膜上，在原位对酵母细胞壁进行裂解，使之DNA。DNA经变性、中和后，可和由外源基因制备的探针杂交。用这种方法，在一张Nc膜上，可完成对几百个子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量子，而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时，子中外源基因拷贝数越多，则杂交后信号越强。
筛选出的子需鉴定表型，即确定是Mut+还是Muts。这两种不同表型在表达的条件上有差异。可以把子同时点在MD和MM两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的子为Mut+;相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的子为Mutd。
(2)将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的性引物(这样做可以鉴定非定向克隆的方向);
(3)用半根灭菌的牙签(节约，而且好用)挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号;
(5)对于PCR扩增性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，8-12小时后提质粒，酶切鉴定确认。
注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多(也就是克隆效率低)，使用PCR初筛可以使工作量大为降低。
(1)接种重组和空质粒子于5ml YPDZ培养基， GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。
外源蛋白在甲醇酵母中的表达分两步，即菌体生长和蛋白表达。先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心弃上清，菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中表达。每隔24小时加一次甲醇，以弥补甲醇的损失。表达的条件有待优化，如通气状况，pH值，培养基的组成等等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大。从摇瓶培养转至大规模发酵。
(3)将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长;
(5)按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h;
(6)对分泌表达，分离样品的上清液;对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用;
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