RNA的动态可逆修饰对其维持体内RNA平衡具有非常重要的作用。RNA修饰，特别是RNA的甲基化，在mRNA，lncRNA，miRNA，甚至是circRNA中都广泛存在。那么，RNA的甲基化修饰会引起他们什么样的变化呢？来自《Cell Research》的报道为我们揭开了RNA修饰对circRNA翻译蛋白的影响。
Circular RNAs(circRNAs)是一类具有环形闭合结构的RNA。现有的研究表明，circRNAs大部分是一类非编码RNA，可通过ceRNA机制或者母基因调控等方式影响生命过程。然而，最新的研究发现，circRNAs是有编码蛋白潜能的，特别是近期两篇研究就报道了能在体内检测到circRNA翻译的蛋白产物。那么，circRNA翻译蛋白这个过程又是会受到哪些因素的影响呢？该研究从RNA甲基化修饰入手，为我们揭开了RNA的m6A甲基化调控circRNA翻译蛋白的过程。
该实验室前期的circRNA研究工作发现，除了需要IRES原件外的circRNA也有翻译的能力。因此，研究人员对这些具有翻译能力的circRNA翻译起始附近的序列进行了分析。结果显示，所以这些具有翻译能力的circRNA启动子附近包含RRACH片段（R=G or A; H=A,C or U），常典型的m6A motifs，且在目前已知的circRNAs中显著富集。
现有的研究发现，m6A对mRNA的翻译效率有影响，m6A很有可能也影响了circRNA的翻译效率。因此，研究人员对此进行了验证。结果显示，在不同拷贝数m6A motifs的情况下，1个或者2个拷贝就已使circRNA具有足够的翻译能力。另外，当具有其他两个引起m6A修饰的RSV和RSVns序列时，也能非常有效的蛋白翻译。同时，这种翻译的特性也能在HeLa细胞中验证出来。因此，该部分的工作表明，circRNA的m6A修饰对其翻译实现非常重要。
为进一步验证m6A修饰对circRNA翻译效率的作用，研究人员进行了RNA-IP实验验证。结果显示，m6A区域有突变（RSV-mut）,Pull down结合效率变低，蛋白产物变少。当共表达m6A去甲基化酶FTO，包含m6A的mRNA(SON mRNA)或者包含RSV的circRNA减少，蛋白产物变少。当共表达m6A甲基化转移酶METTL3/14时，也能增加RNA-IP下来的信号，增加蛋白翻译能力。因此，m6A是否甲基化，直接影响了circRNA的翻译能力。
在mRNA翻译过程中，mRNA的m6A受到热激影响。因此，研究人员通过温度，检测了蛋白翻译能力，发现确实在热激后会增加，而RNA水平没有变化。
那么，m6A启动的circRNA翻译需要哪些蛋白因子参与呢？通过构建eIF4G2敲降shRNAs细胞系，研究人员发现circRNA的蛋白翻译能力降低了，而线性mRNA没有影响。当敲降eIF3A时，也是类似的效果。但是不同的是，eIF4G2敲降对整个蛋白组翻译影响不大，而eIF3A却能降低整个蛋白组翻译，因此，eIF4G2应该更性地影响circRNA翻译。进一步的过表达eIF4G2也验证了该结果。因此，eIF4G2对circRNA翻译非常重要。
前面的体外实验已表明m6A甲基化对circRNA翻译的作用。那么，细胞内含有多少具有m6A的circRNA呢？通过circRNA-m6A-seq，研究人员共鉴定到85个含有m6A的circRNA，进一步的m6A IP验证，发现有13%的circRNA是有m6A修饰的。因此，在细胞内确实有客观存在的m6A位点的circRNA。
为验证circRNA翻译潜能在人组中的普遍性，研究人员对已有的一些circRNA的测序结果进行了分析。结果显示，7700个circRNA中，有25个circRNA具有潜在的蛋白编码能力。其中，有10个能和多核糖体结合。进一步的蔗糖梯度离心实验，高通量测序检测核糖体结合circRNA，共鉴定到250个circRNAs。分析表明，这些circRNA包含更长的潜在ORFs，具有少数和更短的外显子。因此，包含m6A motifs，具有蛋白编码潜能的circRNA在组中广泛存在。
通过质谱检测数据，研究人员分析了细胞内源circRNA可能翻译的蛋白片段，共鉴定到33个肽段是编码于back-splice。通过人工合成肽段验证，胞内的肽段和合成肽段质谱结果高度一致。所以，通过质谱方法确实能检测到由circRNA翻译来的肽段。因此，无论是体外实验还是细胞内验证，研究人员发现circRNA确实可以翻译蛋白。
该研究在一个偶然条件下发现包含m6A motifs的circRNA具有翻译能力，且依赖于起始因子eIF4G2和m6A reader YTHDF3，受甲基化酶和去甲基化酶影响。进一步的测序和质谱验证表明，具有，m6A motifs的有翻译潜能的circRNA在细胞内广泛存在。该研究不光了circRNA编码蛋白的能力，也为理解RNA甲基化在circRNA翻译过程中的作用提供了强有力的。
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