尽管人们已经对许多生物进行了基因组测序，但对树蛙和蓝莓这些非模式生物的基因组还并不了解。正因如此，在非模式生物中进行基因表达分析，很容易得到新的发现。
目前，小鼠、拟南芥等模式生物的基因组和组已经被充分测序，各商家在此基础上开发了大量商业化芯片、qPCR引物、探针组合和一些其他试剂。这些现成的工具为基因表达分析带来了很大的帮助。
然而在另一方面，人们研究非模式生物的基因表达时，可以选择的工具却比较少。不过，这种障碍并不是无法克服的。在二代测序(NGS)、云计算以及一些软件的帮助下，所有人都可以成为非主流基因表达研究的专家。
在过去，树蛙研究者需要通过长时间的实验来构建EST(表达序列标签)或cDNA芯片，再利用这些工具捕获mRNA，最后进行基因表达的分析。如今，RNA-seq可以完美的取代上述技术，美国国家基因组资源中心(NCGR)的研究副Callum Bell说。
为RNA-seq实验做准备其实与制备cDNA文库差不多，只不过在最后“有人帮你进行测序，就是这么简单，”北卡罗来纳大学的生物信息学和基因组学副教授Ann Loraine说，他正在研究蓝莓中的生物活性物质。
不过RNA-seq的成本相对较高，因此Loraine提醒研究者们，要在测序开始前先确定好自己的研究重点，例如研究植物/动物的哪些部分，或者哪些发育阶段。
在对组进行测序之后，我们需要将读取结果装配成为本，并对其加以注释。对于非模式生物来说，这样的注释工作可能比较困难。“我们需要通过可靠途径来解析本的功能，”Bell说。NCGR使用的是蛋白模体的隐马尔可夫模型数据库(例如TIGRFAM)。人们可以利用这些资源找到阅读框，并将序列翻译成为氨基酸。获得了氨基酸序列之后，就可以通过BLASTP等工具在蛋白数据库(如SWISS-PROT)中寻找同源蛋白。
在过去的日子里，人们需要利用本构建芯片，以便检测基因表达的水平和模式。但现在，“倒不如就通过RNA-seq”来获得上述信息，英属哥伦比亚大学的计算生物学家Paul Pavlidis说。
为了帮助研究者们理解自己得到的本，Loraine的实验室开发了大量的计算工具。举例来说，他们开发的CressExpress软件利用了Gene Expression Omnibus数据库等公共数据源，在输入给定基因之后，可以查询同一个基因组中具有类似表达模式的其他基因。此外，Pathway Tools可以帮助人们预测涉及了给定基因的代谢通。Loraine实验室还开发了一个被称为综合基因组浏览器(Integrated Genome Brower)的可视化软件，该软件可以帮助人们直观比对测序读取的结果。
不是所有的实验室都拥有擅长NGS或生物信息学的人才。“测序仪器也还没有那么普及，” Bell说，尽管台式测序仪(例如Illumina公司的MiSeq和Life Technology公司的Ion Torrent)正在慢慢改变这一现状。
另一方面，像NCGR这样的大型核心机构，“已经积累了进行这些复杂实验的丰富经验，”Bell说。现在越来越多的测序数据分析，开始采用云计算基础设施，NCGR自己就在“开发私有的云计算设施，以便为科学家们提供相应的服务，”他说。
目前，许多盈利性机构和非盈利性的核心机构，都能为用户提供付费的生物信息学服务。有些可能拥有专门的生物信息学团队，另一些则主要依赖于云计算进行分析。
这些第三方机构可以提交分析报告，帮助我们理解测序数据的含义。不过，别指望他们能将研究结论双手奉上，因为生物学或临床问题的最终解读，还得取决于研究者自身的专业知识。
测序可以帮助我们分析基因在不同情况下的差异性表达，例如成熟果实和未成熟果实，皮肤组织和肠道组织等。不过这只是一种初步分析，我们还需要通过qPCR等技术对数据进行验证。
Pavlidis指出，初步分析之后的小规模实验(少于200个基因)，就不用继续进行RNA-seq了，因为成本较低的qPCR在这种情况下更加划算。
Life Technologies公司的资深产品经理Sundiep Phanse，推荐大家在做qPCR之前，先在该公司的产品目录里找找有没有符合要求的产品。据介绍，Life Technologies公司提供了超过一百三十万预设计的TaqMan assays，“此外你还可以根据自己的需要进行定制”。
Bio-Rad公司的市场经理Sam Ropp提醒大家，不论是购买预设计的产品，还是自行通过Primer3设计引物都应该考虑到自己序列的特点。举例来说，像单核苷酸多态性、二级结构和可变剪切这样的变量，会对引物的定位产生影响。
对非模式生物展开研究无疑会遇到各种挑战，不过只要树立正确的，找到合适的工具和资源，我们就可以收获只属敢者的励。
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