导读：随着测序费用的下降，新一代测序文库制备的费用已占了实验室测序经费的很大一部分。如今，在许多实验中，文库制备的费用几乎与测序相当。同时，制备文库也要花费相当多的精力。若是将这一过程自动化，不仅能够减少样品之间的可变性，而且能让此过程自动运行，无需人工干预。
随着测序费用的下降，新一代测序(NGS)文库制备的费用已占了实验室测序经费的很大一部分。如今，在许多实验中，文库制备的费用几乎与测序相当。同时，制备文库也要花费相当多的精力。若是将这一过程自动化，不仅能够减少样品之间的可变性，而且能让此过程自动运行，无需人工干预。
当然，大家都很清楚自动化的优点。不过，据Eppendorf应用支持部门的经理Jesse Cassidy介绍，开发一个自动化流程可比你想象得更加复杂。如果你已经习惯了手动构建NGS文库，那么在转换到自动化的液体处理平台时需要注意4件事。
文库制备操作通常涉及到一系列基于磁珠的结合和洗脱步骤。为了让这些步骤能正常进行，磁珠必须是均匀的悬浮液。虽然用手很容易让磁珠重悬，但有了自动化的系统，你就不需要费心。不过要磁珠在文库制备的每个阶段都重悬。在自动化的液体处理平台上，磁珠有可能聚集，如果这些团块不能适当重悬，则后续阶段的所有操作(洗涤和洗脱)都会失败。
Eppendorf的epMotion5075t自动化液体处理系统是NGS文库制备的好选择。5075t利用2D剧烈运动来优化沉淀的重悬，这允许极少量液体的均匀混合。传统的3D混合器需要在混合前密封容器，并在混合后离心，以收集全部液滴，而2D混合不需要这些操作，这意味着操作可以更快速地进行，而不会中断。
去除洗涤液看似很简单，但也要当心，如果未设置好，液体处理器的吸头就不能放置在液面的正确。从太高吸取，吸头将无法触及反应孔的底部;从太低吸取，吸头将形成真空，因为容器底部的压力高。这两种情况都将形成“死体积”，进而后续的洗脱，或影响文库的完整性。因此，用户必须自动化系统，手动干预，以去除洗涤后残留的液体。
在epMotion5075t平台上，一个弹簧调节的磁铁实现了与容器底部的自动接触。有了弹簧式的托板，吸头能够与容器底部接触，彻底吸空容器，同时避免孔内的压力导致真空形成，改善整体性能。
在利用少量材料制备文库时，当务之急是最大限度减少损失。低产量、大的洗脱体积会影响我们产生浓缩样品的能力。然而，所有磁珠都有一个回收阈值，这意味着一些模板将无法从磁珠中回收。
用户可以调整的一件事就是容器的形状。通过一些细节，如软件如何定义您的容器、软件在多大程度上识别容器的形状，以及它如何精确回收小的体积，用户能够控制洗脱回收的能力。在epMotion5075t上，容器尺寸都是精心计算和测试的，可确保高性能和均一性。
最后，我们还要考虑测序反应的灵敏度。试剂体积、流量和温度的微小变化都会导致碱基的替换错误或不完全的延伸。大多数NGS化学处理(如连接和末端修复)都需要热孵育，以最大限度提高酶的效率。理想的情况是，所有反应孔都在同一温度下，以避免样品之间的差异。例如，不均匀的加热可能导致某些孔的连接或末端修复的效率低下。
若液体处理系统使用线圈作为温控装置，则会带来许多这样的问题。epMotion使用Peltier驱动的加热和冷却模块，与大多数热循环仪相同，这使得各孔之间具有高度的均一性。Peltier技术避免了所谓的边缘效应。因此，这个文库制备系统可带来与PCR仪相当的温度控制和均一性。
NGS文库制备是个漫长而繁琐的过程，但自动化能够在很大程度上简化您的工作。精确的液体处理提高了被动和主动化学步骤的准确性，这对酶促反应是相当关键的。十年前，自动化文库制备的市场仅限于高通量的核心实验室。今天，当个人测序仪变得更加实惠，低通量的用户也越来越多地享受到这些好处。有了Eppendorf的epMotion系统，文库制备比以往都要简单得多。
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