对现有谷物进行评价、利用,对大批原始材料(种质资源)及育成品系进行品质筛选,都需要测定种子蛋白质含量.测定种子蛋白质含量的方法很多,一般可分为间接方法和直接方法两大类.凯氏定氮法是间接方法中的一种,国际谷物化学协会(ICC)、美国分析化学协会(AOAC)、美国谷物化学协会(AACC)等及不少国家都把凯氏定氮为标准法.通过本实验学习凯氏定氮法的原理,掌握样品的处理和自动凯氏定氮仪的操作.
根据蛋白质的含氮量比较恒定,平均约为16% ,通过测定样品的含氮量进而推算蛋白质的含量.种子中的氮化物可分为蛋白氮和非蛋白氮.用三氯乙酸溶出种子粉或脱脂种子粉中的非蛋白氮化物(氨基酸、酞胺 和无机氮),沉淀样品中的蛋白质并使二者分离.在催化剂参与下,用浓硫酸消煮分解样品,使蛋白氮为氨态氮,并与硫酸结合生成硫酸按.加碱蒸馏,使氨释 放出来并吸收于一定量的硼酸中,再用标准酸滴定,求出样品中氮含量,乘以16%的倒数6.25 即可换算成蛋白质含量.
(7)混合剂 50ml0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200ml0.1%甲基红 乙醇 溶液混合配成,贮于棕色瓶中.
(2)在三角瓶中加5%三氯乙酸20ml,置康氏振荡机上振荡提取(非蛋白氮化物)lh ,过滤,弃滤液.用5%三氯乙酸洗涤滤纸上的沉淀,最后将漏斗里的沉淀连同滤纸一起放入 1、2 号消化管内,在3、4 号消化管内各加1 张相同滤纸,作为空白.
(3)在1-4 号管内各加适量催化剂及5ml 浓硫酸.置消化炉上,200℃ 消化0 .5h,然后升温至400℃ 再消化0.5h .消化液呈清亮、蓝绿色.
(4)待消化液冷却后,用自动定氮仪进行蒸馏、滴定.仪器可自动打印出结果报告,也可根据仪器给出的标准硫酸消耗体积进行手工计算.
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