几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行,而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集,最常用的就是SDS -PAGE电泳技术,关于大家在此过程中经常遇到的问题进行一些讨论：
A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合 SDS的量几乎总是与多肽的量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合.当量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和量的对数呈线性关系,符合下式：logMW=K-bX,式中：MW为量,X为迁移率,k、b均为,若将已知量的标准蛋白质的迁移率对量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得量.
A：在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的 Tris-甘氨酸缓冲系统.在浓缩胶中,其pH呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白就介于二者之间泳动.由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带.当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白根据其固有的带电性和大小进行分离.
所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素.
A：根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理.
1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT(或Beta巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的,在电泳中,只根据量来分离.一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样.
2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象.100μl样品缓冲液中10μl 20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min.
3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被,不可作为测定量来使用.
A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及密切相关;
制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,具体作用后面介绍;
十二烷基硫酸钠(SDS)：阳离子去污剂,作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白内的疏水作用、去多肽折叠.
A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率.做法：待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用.忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶.一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺.
2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103.
处理办法：加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度.
A：“鬼带”就是在跑大构象复杂的蛋白质时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大,其量要比目标条带大,有时不能进入分离胶.但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用.
处理办法：在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来还原剂的氧化.
A：我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象.主要与缓冲液和分离胶的浓度有关.
A：这种现象一般初学者易出现.比如电压50v以上,可电流却在5mA以下.主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通.包括：a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡).
A：这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响.前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的.
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