(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原,混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比.此方法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100倍,定量范围为5~100μg蛋白质.FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物,均有干扰作用.此方法的缺点是有蛋白质的性影响,即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同,标准曲线也不是严格的直线形式.
试管若干;刻度移液管0.5ml 1支,1ml 1支,10ml 1支;定量加样器;圆底烧瓶;冷凝管1套(带橡胶管);微量滴定管;小烧杯;微量进样器50μl 1支;721分光光度计;恒温水浴器;研钵;玻棒;离心机;离心机.
酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,加蒸馏水700ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中.之后加入85%的H3PO450ml,浓HCl 100ml,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10H.冷却后加入硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g,水50ml,溴水2~3滴,不用回流装置开口煮沸15min,以出过量的溴.待冷却后稀释至1000ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体溴,继续煮沸15min).使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞作为剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度.使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1Mol/L H+酸,此为FolIn-酚试剂乙液(FolIn试剂).
在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱.
(2)标准蛋白质溶液的配制 称取25mg牛血清白蛋白,溶于100ml蒸馏水中,使最终浓度为250μg/ml.
(4)准确到30min后,以不加标准蛋白试管中的溶液为空白,在500nM下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色,测定光密度值.
以蛋白浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线)样品的提取：称取鲜样0.5g,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨提取.
取1.0Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中,然后重复步骤2的(2)、(3)、(4),以标准曲线管为空白,测定吸光值.
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