样品与浓硫酸共热.含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨.经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量.若以甘氨酸为例,其反应式如下：
为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点.收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸.实验和计算方法这里从略.
双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个脲经180℃左右加热,放出一个氨后得到的产物.在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应.凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应.
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量.测定范围为1-10mg蛋白质.干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等.
此法的优点是较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少.主要的缺点是灵敏度差.因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定.(二)试剂与器材
(1)标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(bsa)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用bsa浓度1mg/ml的 a280为0.66来校正其纯度.如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液.牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05NaOH配制.
(2)双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜(CuSO4•5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中).此试剂可长期保存.若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制.
1.标准曲线支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入 4毫升双缩脲试剂.充分摇匀后,在室温(20～25℃)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定.用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液.取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度.注意样品浓度不要超过10mg/ml.
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一.过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代.此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即folin―酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度.这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物.folin―酚试剂中的磷钼酸盐―磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物).在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比.folin―酚试剂法最早由lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤.以后在生物化学领域得到广泛的应用.这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且性较差,干扰物质较多.对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰lowry反应.而且对后者的影响还要大得多.酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用.浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线.含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠―氢氧化钠溶液,即可显色测定.若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠―氢氧化钠溶液的浓度1～2倍.
进行测定时,加folin―酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定,但上述还原反应只在ph=10的情况下发生,故当folin一酚试剂加到碱性的铜―蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸―磷钨酸试剂被之前,还原反应即能发生.
(2)试剂乙：在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4•2H2O),25克钼酸钠(Na2MOO4•2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(Li2SO4),50 毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴.冷却后溶液呈(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤).稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存.使用时用标准NaOH滴定,酚酞作剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1n左右.
(3)标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或g―球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250mg/ml左右.牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9%NaCl溶液.
1.标准曲线支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入 0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml).用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(20～25℃)放置10分钟.再逐管加入0.5毫升试剂乙(folin―酚试剂),同样立即混匀.这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱.然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度值.以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线.
注意：因lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推.全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推.待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收.每分钟测一个样品.
进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格.表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入.最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值.
2.样品的测定：取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20~250微克),按上述方法进行操作,取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照.通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行.即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3个试管.如上表中的8、9、10试管.
注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化.因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质).
1.试剂甲：碱性铜试剂溶液中,含0.5n NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜,配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后,最后加入.
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同.只是试剂甲改为1毫升,室温放置10分钟后,试剂乙改为4毫升.在55℃恒温水浴中保温5分钟.用流动水冷却后,在660nm下测定其吸光度值.
双缩脲法(biuret法)和folin—酚试剂法(lowry法)的明显缺点和许多,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法.
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法(bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用.这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法.
考马斯亮兰g-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的(lmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合.
(1)灵敏度高,据估计比lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg.这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多.
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间.
(3)干扰物质少.如干扰lowry法的k+、Na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法.
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差.
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有：去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠(sds)和0.1n的NaOH.(如同0.1n的酸干扰lowary法一样).
(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.
(1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用无离子水补充到0.1ml.最后各试管中分别加入 5.0ml考马斯亮兰g—250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除).未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管.
(2)加完试剂2-5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595,空白对照为第1号试管,即0.1mlH2O加5.0mlg—250试剂.
注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色.塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡.
(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值a595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线.由此标准曲线,根据测出的未知样品的a595值,即可查出未知样品的蛋白质含量.
蛋白质中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质.吸收高峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比.此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比.利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定.
紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用.低浓度的盐,例如生化制备中常用的(NH4)2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定.特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测,因为此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其绝对值.
此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质
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