大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质所带的负电荷远远超过天然蛋白质的净电荷消除了不同蛋白质的电荷效应,使蛋白质按大小分离.
2、将配制好的分离胶加入制胶槽中,注意应沿着边缘缓慢加入,千万别进气泡. 凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5CM或距梳子齿约0.5CM处.
3、轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水(或正丁醇)封胶,使凝胶表面变的平整,静止30min-1h,使凝胶聚合.凝胶聚合后,在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面,可以微微倾斜模具,检测凝胶是否聚合.
6、迅速将配好的浓缩液添加到分离胶,并将梳子插入凝胶内,至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐,小心避免混入气泡.将凝胶垂直放置于室温下,约30min凝胶聚合.
7、将胶板放入电泳槽中,在上下电泳槽中添加1×电泳缓冲液,使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中.轻轻拔出梳子,注意不要将加样孔撕破.
8、在电泳槽的泳道中分别添加蛋白Marker和样品10μl.加样时用微量移液器将样品加入样品孔的底部,避免带入气泡.
9、接通电源,上槽(加样孔端)接负极,下槽接正极,恒压,起始电压75V,待溴酚蓝前沿进入分离胶,电压增加至105V.
10、 电泳大约需要1.5-2h,待溴酚蓝刚刚跑出分离胶的底部时,切断电源,从电极上拔掉电极插头,取出玻璃板.
11、 戴上手套,小心移去两玻璃板之间的隔片,利用专用的铲子轻轻撬开玻璃板,小心从制胶板上将凝胶剥下,弃去浓缩胶.在右上角切去小片作为定位标记.
13、 从染色液中将凝胶取出用水漂洗后,将胶放入脱色液中进行扩散脱色,直到背景蓝色褪淡,见到条带.根据具体情况,大约需要换2-4次脱色液.
非还原电泳凝胶经扫描进行纯度分析;还原电泳凝胶中量标准,经扫描获得量标准曲线,计算供试品的量.
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