LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(FolIn-酚)的结合与发展.其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后,碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应,形成铜—蛋白质的络合盐.再加入酚试剂后,在碱性条件下,这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定,很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe & PHosPHoTungsTATe),使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物.这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关,所以可以用于蛋白质含量的测定. LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈,其显色效果比单独使用酚试剂强3~15倍,约是双缩脲法的100倍.由于肽键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差.LoWry法适于微量蛋白的测定,对多个样品同时测定较为方便.但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS).
双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物,这一反应称为双缩脲反应.因为蛋白质中有多个肽键,也能与铜离子发生双缩脲反应,且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及量无关,所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量.
双缩脲反应主要涉及肽键,因此受蛋白质性影响较小.且使用试剂价廉易得,操作简便,可测定的范围为1~10mg蛋白质,适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定,能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上.双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大.干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液,如TrIs缓冲液,因为它们产生阳性呈色反应,铜离子也容易被还原,有时出现红色沉淀.
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原,混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物),颜色深浅与蛋白质含量成正比.此方法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100倍,定量范围为5~100μg蛋白质.FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物,均有干扰作用.此方法的缺点是有蛋白质的性影响,即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同,标准曲线也不是严格的直线形式.
试管若干;刻度移液管0.5ml 1支,1ml 1支,10ml 1支;定量加样器;圆底烧瓶;冷凝管1套(带橡胶管);微量滴定管;小烧杯;微量进样器50μl 1支;721分光光度计;恒温水浴器;研钵;玻棒;离心机;离心管.
酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备：称取钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,加蒸馏水700ml溶解于1500Ml的圆底烧瓶中.之后加入85%的H3PO450ml,浓HCl 100ml,安上回流装置(使用磨口接头,若用软木塞或橡皮塞时,就必须用锡铂纸包起来),使其慢慢沸腾10H.冷却后加入硫酸锂(Li2SO4·H2O)150g,水50ml,溴水2~3滴,不用回流装置开口煮沸15min,以出过量的溴.待冷却后稀释至1000ml,并过滤入棕色瓶中,密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈,倘若仍呈绿色,须再滴加数滴液体溴,继续煮沸15min).使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞作为剂,滴定终点由蓝变灰,滴定后算出酸的浓度.使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1Mol/L H+酸,此为FolIn-酚试剂乙液(FolIn试剂).
在测定时要注意,因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在PH值为10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱.
(2)标准蛋白质溶液的配制 称取25mg牛血清白蛋白,溶于100ml蒸馏水中,使最终浓度为250μg/ml.
(4)准确到30min后,以不加标准蛋白试管中的溶液为空白,在500nM下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色,测定光密度值.
以蛋白浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线)样品的提取：称取鲜样0.5g,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨提取.
取1.0Ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中,然后重复步骤2的(2)、(3)、(4),以标准曲线管为空白,测定吸光值.
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