蛋白质中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸.它们具有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在280nm波长处,且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系,故可作为蛋白质定量测定的依据,但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同,故要准确定量,必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较,或且已经知道其消光系数作为参考.另外,不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力,可能发生干扰.其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重.然而核酸的最大吸收峰是在260nm.因此溶液中同时存在核酸时,必须同时测定OD260nm,与OD280nm.,然后根据两种波长的吸收度的比值,通过经验公式校正,以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量.
本法操作简便迅速,且不消耗样品(可以回收),多用于纯化之蛋白质的微量测定.主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时,则产生—定误差,混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值,再按公式推算蛋白质含量.
取试管7支,各管混匀,盛于石英杯中,用紫外分光光度计,以空白管调节零点,分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度.
(一)直接根据标准液与待测液的光密度值(OD280nm),或从标准曲线,求得样本蛋白质含量.
以标准管各管光密度值为纵坐标,以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线,然后根据测定管光密度值,直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量.
1、选一种与待测样本蛋白质 氨基酸 组成相近似的蛋白质纯品,用生理盐水稀释至浓度为lmg/m1,作为稀释标准蛋白质溶液.
准确吸取血清样本0.1ml,置于50ml容量瓶中,用生理盐水稀释至刻度,即500倍稀释,在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算.
注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异,故标准管与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似,以减小误差.
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