DNA 状的,还有一些非线状的,如复制叉和重组DNA 结构.双向琼脂糖凝胶电泳技术就是被人们开发用以研究一些非线状DNA 的.双向琼脂糖凝胶电泳技术(2-D gel)实际上可分为两类：中性/中性双向凝胶电泳和中性/碱性双向凝胶电泳技术.它们的工作原理如下：
中性/中性双向凝胶电泳：非线状的DNA 在琼脂糖凝胶中的泳动行为和线状DNA 相比是不规则的.并且这种行为随着琼脂糖浓度或电压增加而加剧.而这正是中性/中性双向凝胶电泳的工作原理：在第一向中,样品在琼脂糖凝胶中以低琼脂 糖浓度、低电压的条件进行电泳,则DNA 主要根据其量大小被分离.在第二向中,则采用高浓度琼脂糖凝胶和较高电压条件,DNA 的分离则主要根据其形状.
中性/碱性双向凝胶电泳：此方法适合用来分析DNA 复制中间体.这些中间体包括各种长度的新链部分.在第一向中与中性/中性双向凝胶电泳一样采用中性pH,将DNA按其量大小分开.在第二向中,采 用碱性pH,使DNA 复制中间体中新链部分,并按其长度分离,如同在普通琼脂糖凝胶中一样.
双向凝胶电泳在分析DNA 结构方面,最大的特点就是简便易行.它已成功地应用于酵母DNA 复制起点的定位、确定酵母复制叉阻抑点以及DNA 复制剂机理的研究等.但双向电泳也有一定的问题,如得到的图像与理论上的图像不吻合,而且很难解释.如果电泳条件不当,还会产生.本实验所介绍的 实验步骤适用于分析3kb～5 kb的复制型的DNA 性片段.
1、用胶带封好一个胶模,将其放在一个水平的台面上(最好用水平仪检测过).放入样品梳(梳齿底部与玻璃板之间距离为2mm).
2、取适量的琼脂糖粉末和TBE 电泳缓冲液(0.4%琼脂糖,45mmol/Ltris-硼酸盐和1mmol/L 的EDTA)配制凝胶,加热时不时地轻摇玻璃瓶或锥形瓶,确保琼脂糖全部溶解.
3、冷却该溶液至60℃,然后倒入胶模中,让其在室温下静置凝固30min～1h.完全凝固后小心移去梳子和胶带,把胶板移至电泳槽内.
5、取一定量的DNA 样品与6×上样缓冲液混合,注入缓冲液中加样孔内.盖上电泳槽,把电源连在电极上,让DNA 向正极泳动,电压为1V/cm(由两电极之间的距离测定).
8、准备另外一个胶模,但不带梳子.把模子放在一个水平台面上(最好用水平仪检测过),操作要在4℃冷室内进行.
12、把第一向电泳中切下的样品凝胶带水平放置在第二个胶板的顶端,然后倒入含有1.0%琼脂糖凝胶溶液,并使之凝固(都在4℃下进行).
13、移去胶带,并把胶板放到电泳槽内,向槽内注入冷却至4℃的含有0.3μg/mL EB的TBE 缓冲液,使缓冲液超过胶面约1mm.放置循环水泵的导管于电泳槽两极间缓冲液内,使电泳液在两极间循环.
14、 盖上电泳槽并接好电源.DNA将向正极泳动.电压4V/cm,4℃下电泳14h,电泳结束后,将胶板从电泳槽内取出.如果DNA样品已被标记(如32P) 可直接进行放射自显影.若样品没有被标记,可采用杂交的方法.放射自显影可在室温下进行,也可在-70℃下用增敏屏进行.没有标记的样品可用 Southern-杂交或碱性转移法将样品DNA转至尼龙膜上,用同位素标记探针杂交而进行检测.中性/碱双向电泳
3、把从第一向电泳中切下的样品带置于碱性缓冲液中,室温下平衡至少30min.之后将平衡好的样品带平行放置在胶模的一端,温度为4℃.
5、将琼脂糖溶液冷却至60℃后,加入NaOH 和EDTA 至浓度分别为40mmol/L 和1mmol/L,将配好的胶液倒入模子中,让样品带和胶在4℃下静置凝固.
6、去掉胶模上的胶带,把胶板放入电泳槽内.加入碱性缓冲液至超过胶面约1mm.把循环水泵导管置于两极间缓冲液中,并使缓冲液在电泳槽中循环.
7、盖上电泳槽,连好电源.DNA 将向正极泳动(红色接线、中性/碱性双向电泳的样品检测基本相同于中性/中性双向电泳的方法.
1、DNA 片段的大小对双向电泳条件的选择是一个关键因素,本实验所用例子为3kb～5kb.如果DNA 片段超过5kb,双向电泳的条件需要相应地改变.
3、第一向电泳中,凝胶的长度应至少达到25cm,才能更好地分离.0.4%的琼脂糖凝胶比较脆,取梳子时要格外小心.
4、TBE 浓度最初采用90mmol/L Tris-硼酸盐和2mmol/L EDTA.但现在通常所用的浓度仅为其一半即可提供所需缓冲能力.
5、在整个中性/中性双向电泳过程中,要使用同一批TBE 贮存液,以相同的离子强度和pH.
6、在双向电泳过程中,可在样品一端加合适的DNA 量标记物,帮助分析样品的大小和.在第一、第二向中,该标记物都起重要作用,尤其是在第二向中,作用更大.
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