蛋白质有单链、双链和寡聚蛋白等组成形式,组成蛋白质的单条肽链又称亚基.通过对天然蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳和变性蛋白的SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱的比较,可以研究种子蛋白质组成和结构.另外,SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定亚基质量的好方法.通过本实验,学习SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理、技术和实际应用.
用十二烷基硫酸钠(SDS)和还原剂(琉基乙醇或二硫苏糖醇)热处理蛋白质样品,蛋白质中的二硫键被还原,解离的亚基与SDS 发生1 : 1.4 的定量结合.SDS 使蛋白质亚基带上大量负电荷,了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异.亚基的构象均呈长椭圆棒状,各种蛋白质亚基-SDS 复合物表现出相等的电荷密度.在电场中其迁移速率仅与亚基质量有关,因此,SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳可以进行蛋白质亚基分离,并用来测量蛋白质亚基的质量.
( 8 ) 10%过硫酸铵1g 过硫酸铵,加水10ml 溶解,现用现配,冰箱中最多可贮存一周.
( 1)在制板支架上置一专用有机玻璃槽,将固定好的玻璃板下部插入槽内,中部用两个文具夹固定在支架竖板上,在槽内倒入已充分溶化的琼脂,冷凝后封闭胶腔底部.
( 4)待测样品用样品缓冲液配制成lmg/ml 左右的溶液,在沸水浴中加热3-4min,冷却后在台式高速离心机上离心(10000r / min , 10min) ,取上层液备用.
( 5)拔掉样品梳,装好电泳槽,在上、下槽中注入电极缓冲液,用微量注射器点样,每样品槽点样 20-50 μl.在标准蛋白泳道点标准蛋白质溶液.
( 6)上槽为负极,下槽为正极,连接好电泳仪电源,恒压(l00V 左右)或恒流 (30mA左右)电泳.当染料溴酚蓝到达凝胶前沿还有1-2cm 时停止电泳,倒掉电极缓冲液,剥胶染色.
( 7)剥胶后用蒸馏水洗涤,然后浸入染色液中4-5h 或过夜.取出后用蒸馏水漂洗数次,浸入脱色液中振荡脱色,中途更换脱色液数次,至背景清晰透明为止.或进行凝胶干燥.
( 8)凝胶干燥先在一块玻璃板上铺一张用水浸润透的玻璃纸,放上,再盖上一张同样处理过的玻璃纸,用玻璃棒赶出可能窝藏的气泡.然后把玻璃纸多余的四边反向贴到玻璃板后面,在室温下自然风干,制成可以长期保存的透明.
量出染料及各区带迁移距离,以标准蛋白质量的对数对相对迁移率做图,得标准曲线.根据待测样品的相对迁移率,从标准曲线上查出其质量的对数,再求出其质量.
( 2)不同的凝胶浓度适用于不同的质量范围.可根据所测质量的范围选择最适的凝胶浓度,并尽量选择质量范围与待测样品质量相近的蛋白质作标准蛋白质
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