双缩脲法(biuret法)和folin—酚试剂法(lowry法)的明显缺点和许多,促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法.
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法(bradford法),是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的.这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用.这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法.
考马斯亮蓝 G - 250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的(lmax),由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为兰色.经研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合.
(1)灵敏度高,据估计比lowry法约高四倍,其最低蛋白质检测量可达1mg.这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多.
(2)测定快速、简便,只需加一种试剂.完成一个样品的测定,只需要5分钟左右.由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定,且在5分钟至20分钟之间,颜色的稳定性最好.因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间.
(3)干扰物质少.如干扰lowry法的k+、Na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法.
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质,以减少这方面的偏差.
(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有：去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠(sds)和0.1n的NaOH.(如同0.1n的酸干扰lowary法一样).
(3)标准曲线也有轻微的非线性,因而不能用beer定律进行计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.
(1)取16支试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分为两组按表中顺序,分别加入样品、水和试剂,即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml,然后用无离子水补充到0.1ml.最后各试管中分别加入 5.0ml考马斯亮兰g—250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除).未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管.
(2)加完试剂2-5分钟后,即可开始用比色皿,在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值a595,空白对照为第1号试管,即0.1mlH2O加5.0mlg—250试剂.
注意：不可使用石英比色皿(因不易洗去染色),可用塑料或玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色.塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡.
(3)用标准蛋白质量(mg)为横座标,用吸光度值a595为纵座标,作图,即得到一条标准曲线.由此标准曲线,根据测出的未知样品的a595值,即可查出未知样品的蛋白质含量.
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