高效的腺病毒表达系统,用于在人细胞中瞬时及高水平地表达目的蛋白质.由于Adeno-X™病毒DNA中含有特别设计的克隆位点,你可以在2星期内获得高效价的腺病毒,其效率远高于其他腺病毒系统.
腺病毒介导的基因转移可以在人细胞中最高水平地表达目的蛋白质 (1).因为含目的基因的重组腺病毒DNA是游离于细胞基因组外的 (不整合入宿主基因组),所以目的蛋白质得到瞬时的高水平表达.更重要的是利用腺病毒表达系统可以将外源基因转到及不的细胞中表达.
下表比较了腺病毒和逆病毒系统的特点.这两个表达系统是互补的,选择适当的表达系统,就可以把目的基因转入任何种类的人细胞.如果需要瞬时、高水平地表达蛋白质,那么腺病毒表达系统是最佳的选择.
构建重组腺病毒的两种传统方法是以同源重组为基础的.其一是用修饰的腺病毒DNA与穿梭载体在HEK 293细胞中进行同源重组；更为流行的方法采用了穿梭载体与腺病毒质粒一种特殊的菌株(BJ 5183).然后从细菌中收集重组腺病毒,用其感染HEK 293细胞.虽然这些方法是可行的,但由于在HEK 293细胞中同源重组率偏低；或在BJ 5183之前克隆步骤过于复杂,使这两种方法效率偏低(下表).
以体外连接方法为基础 (by Mizuguchi和Kay),CLONTECH的Adeno-X™表达系统提供了一种快速、高效构建重组腺病毒的方法.只需4至7天就可以获得重组腺病毒,如图1所示.由于经过7天的培养之后HEK 293细胞会渐渐失去对培养皿的附着而扩散,导致噬斑融合,用传统方法制备重组腺病毒往往需要铺平板以防止细胞扩散.而用CLONTECH的Adeno- X™表达系统只需4至7天即可得到纯的重组腺病毒,这意味着无需铺琼脂糖平板.
Adeno-X表达系统含有一种小而便捷的穿梭载体―pShuttle,用于克隆目的基因.这种载体的表达框两侧含有极稀少的性酶切位点 ―PI-SceⅠ和I-CeuⅠ.Adeno-X病毒DNA也含有上述两个位点.只需把目的基因插入pShuttle的多克隆位点,然后用PI-SceⅠ 和I -CeuⅠ消化载体,再将含有目的基因的pShuttle片段与Adeno-X病毒DNA(经PI-SceⅠ和I-CeuⅠ预消化为线形DNA)连接.为了提高筛选效率,用SwaⅠ酶切连接产物以除去自身环化或者其他可能存在的非线性的腺病毒DNA（SwaⅠ酶切位点在环状Adeno-X病毒DNA的 PI-SceⅠ和I-CeuⅠ位点之间）.用此DNA大肠杆菌DH5α并筛选重组子.最后,用重组腺病毒DNA转染HEK 293病毒包装细胞系.由于从Adeno-X病毒DNA中删除了E1基因,使其无法感染细胞,这一步需要用HEK 293包装细胞提供反式的E1蛋白,即可得到含有目的基因、有感染能力的重组腺病毒.
在人原代成纤维细胞(BJ细胞)中,用Adeno-X表达系统高水平表达β-半乳糖苷酶.未纯化的重组腺病毒含有来自于HEK 293细胞的lacZ基因,用于直接感染BJ细胞.将细胞培养在常规生长培养基上,48小时后染色.结果显示,被感染的细胞高水平地表达β-半乳糖苷酶.若使用纯化腺病毒(氯化铯离心可产生1012pfu/ml的效价),可获得更高的蛋白质表达.这不但对于更高水平的表达有用,且对于需要用更高效价的腺病毒进行感染的细胞类型也有意义.
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