会不会是你的目标蛋白在最后一个柱子上有沉淀没有洗下来,或者失活了呢,你可以结合你的电泳图看看是不是把所有的蛋白都洗下来了,此外你的纯化工艺很有意思,第一步柱子好象没有太大意义,而且成本高,不如直接上离子交换看看.
首先谢谢你的答复.第一步柱子是去掉大部分与conA结合的蛋白,然后在上的交换柱,文献上基本上都这样,而且电泳显示确实去掉了很多的蛋白.不过我将试试直接上离子柱的效果.
电泳图显示的是除了最后纯化的蛋白外,几乎没有什么蛋白出来.离子交换柱不就是这种性质吗?我一直这样认为,蛋白挂在柱上,经过洗脱液洗脱得到自己的蛋白,没用的蛋白就洗不下来.不知对不对.
conA应该是去除糖蛋白的,离子交换和别的色谱一样也是有穿透的,洗脱也有你的目标蛋白和别的杂质,没用的蛋白不一定都是洗不下来.现在关键是你的目标蛋白如果上离子交换也洗得下来,那没有活性会不会是你的蛋白失去活性,或者是你检测的方法有偏差,有没有可能是pH或者盐干扰抗原和抗体的结合呢.
2)在层析过程中,我只是少量蛋白纯化,并且基本上是在4度层析柜中进行的,没有脱气,结果装柱装了几次,还是有一些气泡(开始在室温中装的,装好后放到层析柜中),由于样品已经处理好,最后一次有一些气泡我也没办法,我只能上样,结果在再平衡过程中出现很多峰,花了几个小时,还是没平衡,时不时又出现一个峰,真的很郁闷,这时我再看柱中的气泡时,几乎气泡都消失了,原来气泡一般都在柱壁上,是不是气泡跑到柱中间填料里去了?出现这么多峰,其它的问题都不存在,是不是气泡的缘故?如果装柱过程中有气泡,层析过程中会出现哪些情况?谢谢!
造成这样的问题主要是因为由于你的液体和柱子中的液体有温差, 这样两种溶液混合的时候就容易产生气泡, 你最好把你的溶液脱气,同时保持管道以及你的溶液温度都差不多,也就是液体也放在层析柜中,这样会好些,你说的问题说明的确是有气泡,气泡不是进入填料中间,而是出去了,或者变更小了,一直出到检测池中,所以一直有小峰上去又很快下来,装柱子装好后再放到层析柜中也不会有气泡的,主要还是有温差造成的,如果柱子中有气泡有两种情况,一是气泡一直不断,有气泡也赶不走,二是可以把气泡赶走,但是越多越难赶,因此最好是没有气泡,否则柱子分离效果也不好.
你说的情况似乎跟我的不一样,我装柱的时候,液体都放在层析柜里,并且恒流泵也放在层析柜中,柱中都是刚从层析柜中拿出来的,还有,我的很多峰并不像你说的那样上去又很快下来,慢慢上去,下得也很慢,持续的时间相当长,不知为什么?很急,做得很烦,是不是填料有问题?
气泡出的快慢和流速有很大的关系,流速慢,气泡比较大,所以上得慢,下来也慢,无论如何我觉得都是气泡的事,尽量要避免有温差.柱子中装的时候一定要没有气泡,否则很难赶走.
那你用更高的盐,如2M做个梯度你看看怎么样.也许你的蛋白要更高浓度的盐才能洗下来. 4)我有一个问题：我们的蛋白原来是用CM填料纯化的,洗脱条件都已经摸索好,最近我觉得我们CM填料有问题,我们还有SP填料,我想请问一下,如果我用SP填料的话,用CM填料的洗脱条件是否适用?能否得到相同的结果?
使用筛时,每一种填料都有一个分级范围,我想请问一下,洗脱体积跟洗下来的蛋白的量之间的具体关系是怎样的?就是说,比如Sephadex G-25 的分级范围在1000～5000,多少柱床体积,量1000的蛋白就出来了?一般洗几个柱床体积就可以了?谢谢!
1.我觉得你换填料,那么条件一般是不会一样的,还得再摸一下条件,如果你是用线性梯度洗脱的方式,那直接重复看看就可以.反正都得做了才知道.
2,很难把握不同蛋白的洗脱体积,因为和你的蛋白特性,浓度,上样量流速等都有关系,做纯化还是得有检测器的,毕竟和除盐不一样.
5)我原核表达了一种His蛋白,买了博采公司的非变性条件下提取His Tag蛋白质的Ni+填料,按照它的说明书在层析是用的Buffer含有Tris,Nacl,甘油和不同浓度的咪唑,洗脱液就含有甘油.我对洗脱液进行了冷冻干燥,可是甘油除不了,不知该怎么办?请指点!
直接透析就可以,你把你的邮件pM给我,我可以把我们的材料发给你做参考,其实不需要用甘油就可以,此外金属螯合最好别选择Tris缓冲液.我不知道博采公司是哪里的,好用吗,什么价格呢.
6)我最近纯化一个蛋白,发现CM填料装的柱用7～8个柱床的平衡缓冲液都无法平衡,并且用7～8个柱床的的氢氧化钠也也洗不出一条直线来,总是有峰出来,不知是怎么回事?请高手指点,希望能指出造成这种现象尽可能多的原因.谢谢!
是不是太脏了,多洗几个柱床体积,或者看有没有气泡,峰型是直上直下的吗,如果是这样那就是气泡.
这次绝对没有气泡,峰型也不是直上直下的,慢慢升起来后又慢慢降下去,也不知道是不是紫外检测仪不稳定?
7)我用amersham的Ni亲和柱变性条件下纯化E Coli表达的蛋白.菌体破碎后,用8M Urea溶解.样品10000g,10min,0.22v过滤,但进样过程中,柱子压力升高仍很快.很快就达到了压力上限,不得不停止进样.
另外,进样过程中压力升高,除了有蛋白,还有什么物质容易堵在柱子里呢?如何在进柱前除去呢?谢谢
1, 在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同,至少相当,你的问题就在于平衡用的4M, 而样品用的是8M, 这样混合, 蛋白就会沉淀, 所以柱压高,没有办法纯化,解决这个问题的方法是AKTA可以倒洗,你用6M盐酸胍或者8M脲含有400mM咪唑反方向冲柱子,这样就可以使沉淀溶解, 同时咪唑可以把挂的蛋白洗下来,这样柱子就好了,用1N NaOH 变性蛋白也不能溶解, 根本没有用.你洗后再用水洗,再做CIP这样还可以好些.否则不用变性剂使蛋白溶解, CIP根本没用,还是堵柱子.此外还有注意的是你的样品很粘加上有甘油,黏度很大,所以相应压力也高,所以不用甘油也可以.
2,你的意思是说你的缓冲液中也有500mMIMI吗,我怀疑那几个峰不是蛋白,会不会是咪唑呢.此外也许有你的目标蛋白,但是浓度低,你得透析浓缩才能电泳看到,或者你用银染的方法看看.我怀疑你前面纯化也许没有你的目标蛋白,所以做这一步没有蛋白或者很少.
而我看的文献30% ACN只会使蛋白变性,不会复性的,除非你的蛋白是亲脂性,水中不溶解,而溶解在有机溶剂中,这就不是复性的问题,,是溶解性的问题.
1,我现在做的镍柱样品和buffer是一样的,都是8M Urea,降低尿素浓度只是一个想法,还没开始实施.
2,我的SEC中的peak1, peak2浓缩跑过电泳,都是我的目的蛋白.我的蛋白疏水性强,较容易聚集,所以才加的甘油.前面纯化应该纯化出来了.
3,SEC最后的peak4, 5用银染做过,没有蛋白条带,浓缩用BCA测过蛋白浓度基本没有.所以应该不是蛋白.这样就很怪了,我的SEC buffer中也有500mM Imidazole阿,基线走平了才进的样,为什么最后还会出峰呢?
4,乙腈的问题是由于有做蛋白结构的文献说我的目的蛋白在三氟乙醇或30% ACN中用CD测,三维结构是对的;也没有聚集体.当然,他们的蛋白是固相合成的.我在做蛋白复性,希望找到一个条件使得我的蛋白不聚集,且有三维结构,所以想试一下.
5,你说的CIP方法很有,多谢了.我用Urea,Gua-HCl,NaOH洗镍柱,柱的颜色都不如水洗时白,是不是变性剂和碱会使胶的状态发生变化呢?
5,碱不能长时间洗镍柱子,那样镍也许会被还原的,何况单独在碱性条件下并不能溶解变性沉淀的蛋白. 8)我在最近不断的条件摸索下纯化到了我的目的蛋白,其中洗脱液是改用含0.1%SDS的系统,这样才能洗出蛋白(还原型谷胱苷肽就不行),但这样得到的蛋白还需要怎么样处理呢?
其实还有一个问题随后出现,就是我之前用的是直接与sepharose 4B混合的纯化方法,就用0.1SDS洗脱可以,但是用预装柱就变成是是elution buffer(含还原型谷胱苷肽)才能洗脱,前者琼脂糖有一些过期而已,其他步骤基本一致,样品也是一样处理的,用SKL溶解包涵体,用TX100增加Binding,不知道为什么结果有差.
还有一点想问一下,上海生化所的低量Marker的每条蛋白带大约是多少蛋白量呀(20ul*20的),因为我不想做蛋白定量先,想先估计一下.
那也许你填料和样品混合时间较长, 所以吸附比较牢固, 因此用elution buffer洗不下来,而要用0.1SDS洗脱, 而过柱子相对吸附较弱, 所以elution buffer可以, 或者是你的这两种填料不一样造成的, 至于Marker我就不清楚了,你最好问卖东西的人,他们也许知道.
10)这里还要麻烦Chromatography兄一次,我作草鱼胰蛋白酶的提纯,用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱提纯.
现在我碰到亲和柱洗脱液的问题.草鱼胰蛋白酶性质和哺乳动物的不同,哺乳动物的是碱性蛋白酶,而草鱼胰蛋白酶是酸性蛋白酶,在酸性区域不稳定,国外资料和我作的预实验都证明了这一点.经典的哺乳动物胰蛋白酶的提纯方法用pH2.5的酸性洗脱液洗脱,而这种方法对我的草鱼胰蛋白酶的提纯不适用.国外资料有苯甲脒琼脂糖凝胶提纯鱼胰蛋白酶的,用120mM苯甲脒在中性区域洗脱.我的卵类粘蛋白合成的SEPHAROSE-4B亲和柱能用120mM苯甲脒洗脱吗?
苯甲脒琼脂糖凝胶可以用苯甲脒洗脱,但是我不知道能不能用在你的柱子上,因为按道理蛋白和这两个填料的作用位点和方式也许不一样,因此我觉得不一定能用,除非它们作用方式是一样的,最实际的就是试试就知道.
此外我觉得既然文献用的是苯甲脒琼脂糖凝胶,那你也可以用这个填料,其实我们公司就有这个填料.此外你也可以换个配基例如胰蛋白酶剂做配基,不过一般都是用降低pH的洗脱,所以实在没有办法你还是得用苯甲脒琼脂糖凝胶.
11)我用的介质是CM52(羧甲基纤维素的),柱子的直径是7CM,介质在上样过程中经常出现裂纹,请问这是为什么?这个问题怎么解决?
我怀疑是填料压得太紧,样品和平衡缓冲液是一样的吗,温度是一样的吗,我怀疑样品上柱子有气泡才会有裂纹,否则是不该有的.你要样品和平衡缓冲液温度一样,别直接从冰箱里拿出来就上样.
阴离子柱一般都用TRIS-HCL,或者有用磷酸缓冲液但是前者对我的酶活有影响,后者PH值不够高,所以决定换BAFFER,不知道选择BAFFER的时候有什么依据
应该没有问题,其实缓冲液不过是调pH的,低浓度对离子交换影响没有象一些书上说的那样说不能用某个缓冲体系.所以我觉得大多都比较随意,常用的都是可以的.
13)真搂主的豪言壮语,你果真能“制填料如煮小鲜,做纯化似拂轻尘“吗?我不太相信,国内好多前辈和专家都不敢这么夸口,我做了6年的蛋白纯化和填料合成工作,我觉得这个领域要做好,做精并不是一件轻松的事情.
“制填料如煮小鲜,做纯化似拂轻尘“是我对填料合成的理解,那就是填料合成和做汤差不多,就是熬,而纯化就象把杂蛋白象灰尘一样吹去才得到目标蛋白,我不觉得做填料和做纯化很容易.专家和前辈现在亲自做实验的不多,而做产业的更少,我也做了11年的纯化和填料,包括小的HPLC和生物大的中低压色谱,既然你是同行,有问题以后向你请教,精是要静下心来做的.我觉得做产品最难.14)我有一段小量的蛋白,5KD左右,4对二硫键,表达后以包涵体形式存在,
这是我的电泳图谱,第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带,我需要复性,这是一段杀菌蛋白,我要复性之后做抑菌圈.我用的pET-3C的载体,BL21表达
目的蛋白量大概在9万左右,想除去量8万以下的杂质,而且希望除的尽可能干净,但是我看了millipore的资料,如果选择3万截留量的膜,还有不少3-8万的杂质,不知道选择8万截留量的膜能不能最大可能的去除8万以下的杂质?最适当的膜应该是哪种?
选择5万截留量的膜是否能5万以下的都能除干净(95%以上吧)?其实目的蛋白只要损失不超过三分之一我都可以接受,但是一定要去除3万到5万之间的那些小,不然会影响我的检测.
我超滤用得不多,好象没有这么能截留80KD以上的膜,如果你的样品不多,直接过凝胶过滤柱子就可以,你选择排阻范围上限为80KD的填料,例如sephadex G-75范围在3000-80000,这样在外水体积出来的正适合你需要大于80000的样品,快,简单,而且不需要复杂设备.如果用superdex 75 范围在3000-70000,效果也许更好,
2,如果样品体积相对于上样量太大您比较常用的浓缩方法是什么?我有透析袋,PEG ,大容量冷冻干燥设备和50ml的脱盐柱,很小的超滤管可供选择.
3,我依次用离子柱,疏水柱,亲和柱纯化我的蛋白.过了离子柱之后,我发现不挂柱的部分和梯度洗脱下来的某一部分都能检测到活性(我提纯天然酶),这可不可以说明他们是不同蛋白? 我把在离子柱上梯度洗脱下来的那一部分再经过疏水柱之后上亲和柱(染料,red),用2M的盐洗,发现在小于1M和接近2M的地方有两个活性峰,这能不能说明这又是不同的蛋白?最终SDS-PAGE发现这"两个"条带量相差一点点,但是按照文献上应该只有一个活性很强的蛋白,我却得到这样活性很弱的"两个"蛋白,真是越做越糊涂了.
超滤设备当然有大的,你可以和密理博或者颇尔公司联系,他们会给你详细回答的,我做纯化大多用疏水和亲和多,所以不怎么浓缩,小量可以用透析袋,大量的可以用超滤,如果要做成粉末长期保存那就冷冻干燥.
不挂的部分不一定是另一种酶,因为柱子不可能是100%挂住,何况超载时穿透也会有活性,还是用电泳检测看是不是在同一个都有.洗脱做电泳差一点很难说,因为电泳的带不一定对得很齐,你把两个样品混在一起跑,这样看是不是一条带,如果是很可能还是一个东西,活性的强弱得看你操作本身有没有降低活性的可能,如果是这样,那说明在纯化过程中有活性损失,染料亲和有洗脱需要洗脱,例如用辅酶洗脱的,你看你的操作和文献是不是一样,此外提取有没有问题,还有是不是浓度太低所以活性低.
我要做的His融合蛋白是细胞表达后提取出来的,上样体系是否要和柱子平衡体系一样呢?因为没有检测器,请问大概要用多大浓度的咪唑来洗脱?
我们公司的镍琼脂糖凝胶是已经螯合好镍了,不知道你用的是哪家公司的,一般如果是蓝绿色的,那是螯合好镍了,如果是白色的,那就没有,再生很难在这里说清楚,你PM你的邮件地址给我,我把我们的材料发给你,很详细,包括操作也是,样品最好是pH和盐浓度同平衡缓冲液一样,一般你买的填料都有说明书,就有怎么操作的,我可以把我们的操作发一份给你做参考.不同蛋白洗脱都不一样,你看我们的说明书就比较清楚了.
18)准备纯化一多肽体,量17000左右,,准备先用G-25除盐,在分别过sp-sephrose FF,DEAE-sephrose FF,体裂解成单体后,由于单体量4000左右,PI和原来差不多,所以想重复体一样在进行纯化.
若学长有更好的想法请尽管不吝赐教.G-25除盐速度快吗?操作条件：平衡,洗脱液,柱的大小,都望指教
如果你的样品等电点是4.3,那用DEAE-sephrose FF比较合适,而sp-sephrose FF很难挂住,当然如果pH在2左右也许能挂柱,但是不知道在这样条件下你的蛋白稳定性如何.得到体后用什么方法裂解,这个说清楚才能说选择怎么样的柱子,简单重复不一定能得到好的效果,除盐很快,一般上样的多少取决你柱子的大小,也就是说你处理的样品体积,一般除盐可以上样到填料体积的25%左右,洗脱就用你不含盐的缓冲液,也就是平衡DEAE-sephrose FF最好.除盐柱子一般离子交换平衡缓冲液洗冲柱子3个柱床体积就可以,柱子不需要装很高,短粗柱子就可以除盐了,你没有告诉你要做多少样品,抱歉没有办法给你说要多大的柱子.
多谢指点,sp sephrose-ff 我是打算用来出去带+电蛋白的,所以这步我是否可以、只收集过柱液,而不要去洗脱了,我用溴化氰裂解的,你的意思是否我可以只用DEAE SEPHROSE-FF就可除盐了,不用再用G-15之类的,我是用来进行50L罐后的纯化的,小肽量如上,很小,选柱要以此为依据,但我对柱的参数不懂,请指教
别客气,其实我觉得sp sephrose-ff 也可以,看你怎么配合了,DEAE SEPHROSE-FF不能除盐,但是如果你选择挥发性的盐,那也许不需要过凝胶柱子就可以,此外如果是4000的多肽,只能选择sephadex G-10除盐,不知道效果好不好,G-25不行,因此如果量很大的话,还是用挥发性的盐吧.仅用离子交换不好的话,你可以考虑反相,但是量大成本比较高,因此你也可以试试疏水
抱歉,不知道你要纯化多肽量在什么范围,做多大的规模,这些不清楚很难说选择什么填料和柱子.
纯化小肽最好用反相色谱,它的分辨率是色谱方法中最高的,C18或C8柱都可以,如果你的小肽中芳香氨基酸的含量较高,也可以考虑苯基的反相柱,小肽经过反相后通常结构能够得到恢复,如胰岛素.仅供参考.
20)前几天我提取了一种菊科植物的蛋白,用的是tris—Hcl缓冲液,然后用100%丙酮沉淀蛋白,结果蛋白中含有色素杂质,属水溶性,颜色很深,请教高手,如何除去色素干扰,纯化蛋白??
另外我也查了一些资料,说可能是花色素,于是我在100%丙酮沉淀后,加了一步0.1%甲醇,但是并没有显著的效果chromatography wrote:
你说的花色素就是黄酮类的花青素吗,它有很强的亲水性,所以丙酮沉淀它也沉淀,你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀,这样色素就不会被沉淀了,你试试吧.
chromatography,您好.为什么"丙酮沉淀它也沉淀,你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀,这样色素就不会被沉淀了"呢?谢谢!
我觉得因为是水溶性的色素,在乙醇和高盐中能溶解,而蛋白沉淀,这样可以去掉一些色素,其实色素是小,也可以超滤透析过凝胶过滤都可以去掉一部分,结合起来也许能去得更干净点.
21)作完外源基因表达后想纯化上清中6kd糖蛋白,看了一点文献也不确定如何选择柱子,正着急.你看先过筛再过疏水或离子柱行吗? 关键是想您给一些关于各类柱子型号、特点以及装柱操作的链接或书(希望能全点),帮我扫一下盲.可以吗?另外上清中的色素用筛可以和目的蛋白分开吗?
糖蛋白有专门的亲和柱子,例如凝集素的柱子,你的蛋白上是什么类的糖就可以用专门的凝集素亲和柱子去做,当然也可以用硼酸琼脂糖凝胶去纯化糖蛋白,我们公司就有这样的填料,当然你也可以选择离子交换和疏水试试,具体的方案得看你现在手头有什么条件,我觉得如果是离子交换和凝胶最好先过离子住,再过凝胶柱子,如果是疏水,那可以用硫酸铵沉淀配合疏水,不知道你的上清目标蛋白浓度大不大,太具体的那就很难三言两语说得清楚,何况你没有提供蛋白的等电点,所以很难说选择这么离子柱,也没有上清电泳图,所以不知道选择什么凝胶的填料,不知道什么糖,很难知道用什么凝集素的柱子,硼酸琼脂糖凝胶倒适合各种糖蛋白,而且成本也低,也许值得考虑.
22)我想用反相Source分离蛋白,说明书上说可以耐受6M Gua-HCl,我的蛋白溶于8M Urea中,不知道Urea会不会对source填料造成影响?Urea会不会影响蛋白的binding呢?色谱园上有一个实例用SOURCE分离包含体蛋白,不过进样时样品是在盐酸胍中的,没见到用尿素的阿.
还有,反相的A液为TFA in water,在这种条件下,是不是应该先做一下我的蛋白的溶解性试验呢?随着洗脱时ACN的增加,蛋白会不会沉淀出来呢?这样,柱子很容易会被堵掉的.我试过不加TFA的ACN溶解我的蛋白,30%以下的ACN无法溶解,我的蛋白疏水性较强,非变性buffer中溶解性很小,那么加入TFA就可以蛋白百分之百溶解么?
能用6M Gua-HCl那耐受8M Urea完全没有问题,这个填料很稳定,脲也不会影响binding的,我觉得还是用Gua-HCl好一些,,因为它溶解包涵体的能力更强.一般的蛋白在TFA in water这样条件下都能溶解,但是我不知道包涵体蛋白可以不可以,你参考文献做吧.通常HPLC做蛋白和多肽在洗脱时ACN增加不会使蛋白沉淀,如果不加TFA不溶解是很正常的,因为没有它一般的蛋白都难溶解在ACN水溶液中,加入的话应该可以增加你蛋白的溶解度.100%的溶解那也得看你蛋白浓度和本身的特性.
23)我要纯化的蛋白是一种酶,过完阴离子柱后还有酶活,但接着再过个疏水层析柱就没有蛋白吸收峰也没有酶活了,我的蛋白去了哪里?所用疏水层析柱柱体积只有1ml,是否有影响?24)我要纯化的蛋白是一种酶,过完阴离子柱后还有酶活,但接着再过个疏水层析柱就没有蛋白吸收峰也没有酶活了,我的蛋白去了哪里?所用疏水层析柱柱体积只有1ml,是否有影响?
我怀疑你的蛋白也许在苯基柱子上没有洗下来,你可以用20%乙二醇水洗看看有没有东西,和柱子大小关系不大,你纯化什么酶呢
我纯化的是真菌发酵液里的葡聚糖酶,量很小,即使硫酸铵浓缩后酶活也没有显著提高,电泳凝胶用考染只有几条很淡的条带,所以一直在用银染.过阴离子柱时我用的是PH7.0的Tris-HCl平衡柱子和1M的NaCl洗脱,在10-15%时目标蛋白就被洗了下来.您认为我有没有必要改变PH再过阴离子柱.
疏水层析对蛋白的稀释大吗?有没有可能我的蛋白本身就太少所以被稀释的找不见了.用20%乙二醇水洗是上样后直接用20%乙二醇洗脱还是低盐洗脱后再用20%乙二醇洗,20%乙二醇会影响酶活吗?是乙醇还是乙二醇?
离子交换如果挂住,洗脱下来比较快,那你可以改变pH试试,提高pH到8-9看看,这样是不是结合更牢,此外如果你的蛋白是葡聚糖酶,那你直接用sephadex G-25这样的柱子也许能做亲和填料,挂住你的蛋白,可以试试,因为它的底物是葡聚糖,而sephadex是交联的葡聚糖,测定上柱前的酶活,上样完后看总的酶活有没有降低,如果是,那可能被吸附,然后改变pH或者盐看有没有东西下来.
疏水不会稀释你的蛋白,如果被挂住它和亲和一样有富集的作用,用20%乙二醇水洗只在洗脱的时候用,别的缓冲液都没有,此外疏水和时候配合硫酸铵沉淀,如果你沉淀没有,那也许浓度太低,沉淀不下来.
聚合体如果小于病毒颗粒那完全没有问题,你可以用琼脂糖凝胶6BFF或者脂糖凝胶4BFF,一般的层析都不会使蛋白失活离心也不会,离心很难做得很纯,如果差别很大也许好些,如果要得到纯的样品,不过柱子很难做到.
层析做病毒完全没有问题,我用我们公司的离子交换和琼脂糖凝胶6BFF做过病毒的纯化,很好用,而且纯度很高,很清晰的带,滴度也很高.
26)目前我们需要大量提纯小鼠血清中IgG,我做过了预实验：辛酸-硫酸铵粗提后,再以阴离子交换树脂(DEAE sephadex A-50)进行层析,看帖子说此法提纯IgG效果较理想,但我做后,跑SDS-PAGE电泳,仍有不少带,且得到的量非常少.现将大致过程写出,请您指点其中不足之处,帮我分析一下原因,由于初接触蛋白方面,知之甚少,望不吝赐教,谢谢!
3 透析液2ml直接上PH8.0 PB缓冲液平衡好的 2.6×15cm的DEAE sephadex A-50柱,并以同缓冲液洗脱(据说IgG不挂在柱上,直接流出,而其它杂蛋白挂到柱上),以紫外分光光度计测A280吸收值,测值结果发现,几乎没有高值出现,约收集了120ml洗脱液,选了几管有值的跑电泳,带子相当微弱,不知蛋白跑哪里去了?
后来不采用过柱方法,直接将2ml透析样品与1ml sephadex A-50胶直接混合,4度过夜,离心取上清,但电泳后仍有许多带.
另外,有说以亲和层析方法提纯鼠IgG,纯度较高.我们头儿让我找溴化氰活化琼脂糖凝胶后偶联的方法提IgG,我没在网上找到相关内容,这里看到您又提到用环氧丙烷活化琼脂糖凝胶,此法更好,如果您方便能发一些溴化氰和环氧丙烷活化琼脂糖凝胶的具体方法以及接下来的偶联和纯化相关资料到我邮箱吗非常感谢您!
抗体这样纯化的方法我没有做过,你可以参考下面的帖子,我也有相关的材料,其实硫酸铵沉淀后直接过苯基柱子就效果很好,直接过亲和也可以,你这个方法文献虽然说,但看来不一定好用,我怀疑还是操作的条件.
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