IEF用Biorad的圆盘电泳槽(不行用国产的吧,不推荐),SDS-PAGE用六一厂的就可以了(ft,六一厂应该给我money吧,给你做广告了)(money不是很多的强烈推荐六一的,买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧,呵呵)
BIO-RAD 的圆盘电泳槽,国产的不推荐,因为 上槽 Biorad 的铂金丝凹进去了一点,不是很进去,而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈,影响电聚焦.
干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部,在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上.电聚焦的管子,买原装的也可以,实在不行自己也可以做的,1ml 的移液管,内径1.5mm左右的,长度取18cm,用玻璃刀做,呵呵,很容易的;玻璃管的处理,先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr,用自来水冲后;用双蒸水冲,用双蒸水泡至少1hr,中间至少换2,3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 个小时,用双蒸水冲,(不能用自来水冲),然后双蒸水泡至少1 个小时,中间换3,4 次水,可多泡一会.最后泡在无水乙醇里面1hr,轰干就可以用了.
用注射器吸好胶液,装上7号针头,将7号针头插入玻管底部,边推注射器边提针头,直到标记处,用微量进样器小心加入少量水,可见明显的界面出现,让其聚合1小时以上,适当长一点的时间好一些,我一般是头天下午灌胶,第2 天下午才开始跑电泳.待胶聚合好后,除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液,加样80μg,再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要样品与NaOH 的界面.即可进行电泳.电极液为：上槽(负极)为50m mol/L NaOH 液,下槽(正极)为25m mol/L H3PO4.按 200V×15min,300V×30min,400V×18h,1000V×1h的程序进行电聚焦.或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,特别是冬天,我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37 度暖风机和电泳槽在一个大的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好.2.3.1.3 电泳后的凝条处理
电聚焦完毕后,用注射器吸满水,套上一个200μl的枪头,当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气.从顶部向下注水使胶条向下滑出.当然,刚开始做的时候肯定不熟,很不爽,有时候你会唱 想哭却又哭不出来,呵呵,熟悉了就快了,注射器 枪头玻璃管必须为一直线,消息不要把注射器的头搞断了.取一胶条,用双蒸水洗净两端,按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段,各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜,次日用酸度计分别测定各段的pH值,以凝胶长度为横坐标,pH值为纵坐标作图,即为等电点标准曲线 卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200 卫生枪头,水不从枪头和管子处流出来,注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久,想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑.绝招哦,不要随便乱传,嘿嘿!还可以马上看一下,胶条上有蛋白质没有,有的话一下就可以看见了.那些说什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵!就跟你用考染IEF 胶条一样的,带,可能先在12%的TCA 里面看不见,不过你再把它放在水里面,泡一会带就出来了.不过在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5 次水,每次用不同的小平皿.
注意到下级液 磷酸 部分的胶条没,是不是有一节约2cm左右,比较突出,没有膨大的部分呀!只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢,大约3cm左右,呵呵!
选用DYY-Ⅲ型(六一仪器厂生产)电泳槽(规格为200×200×1mm),分离胶浓度为12%,无浓缩胶.待胶聚合后,将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端(避免胶条拉直),并用1%琼脂糖(电极缓冲液配制)封胶,特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮.61 厂之灌胶：不用凡士林,用透明胶将两端(的2 边)封住,再用2%琼脂之SDS-PAGE 电极液封底,待琼脂凝固后再灌胶,最后用水封胶.over!
做之前,一定要,1,灌胶不会有任何问题,不能漏,2,不用浓缩胶,只用分离胶.3,分离胶用水封,要凝聚好的PAGE 胶,为一平的线,凹来凸去的就不要用了.玻璃版能用硅化剂最好不过了.防止从边上漏,我用透明胶(约4cm宽),封住两边,下面还是用2%的琼脂封.灌好电极缓冲液[25m mol/LTris,192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS],按25mA/板胶恒流进行电泳,待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳,一般电泳耗时约4-5h.银染：凝胶于40%甲醇,10%醋酸中固定1h以上或者过夜;用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min;水洗6×5min; 0.02%硫代硫酸钠1min;水洗3×20s;0.2%硝酸银,0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%硝酸银,0.02%甲醛20min;水洗3×20s;显色液(3%碳酸钠,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸钠)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸钠)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的线%甘氨酸停显.染色理想温度：我去年4,5月时,通常染色都定在中午,12点多;温度最好是20 度左右,(这个温度我也没控制的)100%TCA领一瓶TCA 500g的那种 按克隆上的好象是直接加200多ml 水就成100%TCA了10%TCA,0.07%2-ME 丙酮 (100ml)：
(2)加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1 小时)弃上清.
(3)加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用.
(4)上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用.
(3)去掉胶条的膜,胶面朝下,先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中,慢慢下压胶条,并前后移动,避免生成气泡,最后放下胶条平端,使溶液浸湿整个胶条.
(1)将胶条放入10ml 平衡缓冲液中(加入10mgDTT)封口,在振荡仪上振荡15 分钟.
(2)将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中(加入250mg 的碘乙酰胺)封口,在振荡仪上振荡15 分钟.
封胶溶液：SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附：蛋白质含量测定的方法(Bradford 方法)
原理：这一方法基于2 考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式.在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定.反应化合物在 465-595nm处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量.溶液：
样品制备是做好2-d 的关键,这句话好象有点多余,如果样品中离子浓度过大,根本做不了2d,我开始的时候由于提取方法有问题,结果浪费了很多时间和IPG胶条,真的很心痛呀!另外再说明一点,最好用新鲜的样品提取蛋白质,蛋白点的差异很大,新鲜的样品点多,而我用存放在-80 的样品跑出来效果差了很多呀!如果你不确定你的蛋白提的如何,你先跑sds-page.检验一下.关于蛋白的提取方法,我还想听听各位的.
2、上样量的问题,我觉得我跑的这张2D 图,上样量还需要调整,可以适当降低,我的ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间,上样量不合适,丰度低的将会被丰度高的所遮盖,这是最讨厌的问题.
3、跑一向的时候大家都差不多,根据公司的说明就可以做了.跑二向的时候我现在一般做恒压,以前做过恒流,没感觉有什么差异,还想请教各位!横流和恒压到底哪个更好一些!
4、ipg 胶条ph 的选择,我做的是植物的花药,一般情况下酸性端点多一点,碱性端较少,我现在选用的是ph3-10 的,我觉得很不合适,(不过这个胶条是免费的)因此好多点没能很好的分开,如果胶条的ph小一点,胶条(我希望能达到18cm)可是我们这里做不了,效果应该比这个好很多的!
6、针对不同的蛋白质,分离胶的浓度也是可以调节的,我比较懒,就作过10%,12.5%的,不过觉得都不适合.
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