2)求助,我有一段小量的蛋白,5KD左右,4对二硫键,表达后以包涵体形式存在,请问,我怎么设计我的纯化步骤?我用过离子交换柱,纯度可以达到60%,但是不知道下边该怎么做?望赐
这是我的电泳图谱,第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带,我需要复性,这是一段杀菌蛋白,我要复性之后做抑菌圈.我用的pET-3C的载体,BL21表达
你好,我做复性不多,你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献,我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的,还有用伴侣,你可以多看看再尝试.
至于纯化,如果你的蛋白有游离的巯基,那我觉得很时候用以前的共价层析,专门对于巯基进行纯化,那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道现在还有没有这个填料,你可以问pHarmacia公司的人.你pM给我,我可以把这个材料发给你,如果没有,那你只好用离子交换,凝胶过滤,你的既然抗菌,你知道是什么原理,作用于什么部位,和什么结合,那也许可以用亲和的方法,我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构,你也可以用疏水试试.同时是包涵你可以先把包涵体溶解,然后降低变性剂的浓度,这样类似分级沉淀,你就可以得到很纯的包涵体,再纯化就容易了,总之我你先分级沉淀包涵体,再做纯化.这样省事点.
3)我的蛋白是水溶性蛋白,还有整个操作过程所用的缓冲液都一样.根据氨基酸来看等电点大概4,我的缓冲液PH为8.包涵体溶解液大概10ml吧,稀释成100ml透析去除SKL,然后PEG20000浓缩回10ml,取一半上Sephadex G-100,峰形很漂亮,SDS-PAGE检测去除了部分杂蛋白,收集峰再用PEG20000浓缩成5ml,上DEAE-Sephadex A-50,上样后可以看到柱顶部挂着蛋白,但是NaCl浓度从0.05M上升到0.8M只洗脱了杂蛋白,后来我怕是NaCl浓度不够又加到1.5M,还是不行.
4)我是搞药剂的,想请教一个问题,我将量458.5的药物包裹在平均粒径约100nm(粒径范围50-400nm,材料为单硬脂酸甘油酯,量358.6,采用药剂学方法聚合成载药纳米粒,聚合后量我也不知道,只知道粒径)的纳米粒中,现想将游离药物和载药纳米粒分离,请问应该选用何种规格型号的Sephadex填料?文献有用Sephadex-G50的,我有Sephadex-G15,不知可否?谢谢!
我原来也是学药的,根据你的说法那你的颗粒是比较大的,其实最简单的方法就可以用超滤这样处理量也大,快,便于放大,如果是少量用透析也可以,没有必要跑色谱,如果你想用,那Sephadex-G15不行,因为你的纳米粒过不去柱子,会聚集在柱子或中间,G50也也这些,你可以选择4-6%的琼脂糖凝胶,病毒颗粒等都可以穿过,这个填料更合适.
都可以,看你手头有什么材料了,过柱子会稀释样品,透析稀释得少些,透析后还可以用peg浓缩,你喜欢用什么都可以.过柱子快.
6)我的目的蛋白PI9.0,用弱阳离子交换层析(CM52)分离,请问平衡缓冲液(PH3.75)与上样液(PH4.0)这样大的PH差距会影响目的蛋白与介质的结合吗?
7)请问chromatography ：我提纯的包涵体蛋白在经含不同浓度尿素的PBS中透析时析出来了,有什么办法可以复溶吗?我要用此蛋白去打动物.另外我的蛋白是用8M尿素裂解后用镍柱纯化的,洗涤液用的是含20mM咪唑,洗脱液用的是含250mM咪唑,但是纯化后跑SDS-PAGE发现,在洗涤液最后一管中己有我的目的蛋白,没有杂带,但在洗脱的第一管中就开始在紧邻我的目的蛋白的上方出现一条杂带,并随着我的目的蛋白洗脱浓度的降低而降低,后来我试用的增大洗涤液中咪唑浓度到40mM,结果还是一样,不知是什么原因,请问有更好的方法用镍柱纯化包涵体蛋白吗?如果我想纯化后不用透析就去打动物,有何方法呢?请多指教!谢谢!
加到2M硫酸铵,上苯基琼脂糖凝胶,核酸被吸附.蛋白不一定能被挂柱,阳离子柱子通常不吸附核酸的,你蛋白能被阳离子吸附,而核酸不能,这样不就可以了.所以最简单的是使核酸和你的蛋白带相反的电荷,这样用阴柱或者阳柱都可以达到你的目的.
9)我做的原核表达GST-融合蛋白,用的是Glutathione Sepharose 4B的一次性小柱子,pharmacia公司的,经过反复试验,现在已经纯化出来了,期间曾得到你的指点,再次表示感谢!
现在我要开始大量提纯蛋白了,为了节省时间,我想问一下有没有类似Glutathione Sepharose 4B的用于大量提纯蛋白的进口柱子,就是说不用自己配填料的,直接用的这种柱子?若有何处可买到?
你需要多大的柱子呢,进口的好象只有5ml的预装柱,大的要自己装填,其实自己装是一样的,没有什么差别,我发了一些材料给你了,你可以考虑用国产的.
10)我最近买了一个Amersham的中空纤维浓缩换液柱,柱子的说明书上说能承受的最大压力为15psig, 不知道psig和MPa之间怎么换算啊?15psig相当于多少MPa呢?多谢!!
11)有在柱子上切的,也有纯化后切的,切下的片段可以用原来的亲和填料去除,凝血酶也需要去除的,你可以看下面的一些材料吧：
去除一般用肝素琼脂糖凝胶和苯甲脒琼脂糖凝胶.12)我们在做多肽的纯化,都是制备用的,不知道该用哪家的填料,现在有很多厂家来推销,Vydac,Kromasil,YMC都有,不知道哪家的反相硅胶比较好呢?
13)你说阳离子柱子通常不吸附核酸的,为什么我用PH4.0上样,PH9.0洗脱,洗脱液测紫外吸收值时总在260有很高的的吸收值,难道不是核酸,那会是什么呢?
也许别的物质也这样把,你可以把样品跑一下琼脂糖凝胶电泳,看看是不是就知道了.核酸酸性如果不强,你怕pH提高到5-6,这样核酸应该就挂不住,你偏酸性太多,那也许有一些会挂住,你试试吧.
14)您好chromatography ,我是新手,现在正在做牛血蛋白质的纯化,希望得到纯化的白蛋白和IgG.打算用盐析的方法先粗提白蛋白和球蛋白,然后层析分级,再超滤浓缩除盐.现在遇到的困难是层析这部分,特向大狭您请教.
白蛋白和IgG分别应选用哪种层析方法?填料选择什么?洗脱液具体选择什么(分段洗脱)?每次上样量最大能到多(制备型)?多长时间能过完一次?柱子的寿命一般为多少?洗脱液流速控制到多少?
现在还没有做样品的电泳,所以还不知样品中杂蛋白和含量,只是在盐析中先用22%硫酸铵将纤维蛋白除去,用33%盐析出IgG样品,用50%除去拟球蛋白,用65%盐析出白蛋白样品.其中能提供以下数据①牛血清白蛋白：量：66210;形状：椭圆形;大小：40?*140?;等电点：4.7;血浆中的含量：52.0g/L.
③另外,我从书上看到说：凝胶过滤在分级方法中分辨率为中等,但对脱盐效果优良;流速较低,对分级每周期约≥8小时,对脱盐仅30分钟;适用于大规模纯化的最后步骤,在纯化过程的任何阶段均可进行脱盐处理,尤其适用于两种缓冲液交替时.
白蛋白最好用蓝色琼脂糖凝胶纯化,很好用,我们都用它专门去除白蛋白,你需要我可以把材料发给你,至于IgG可以用重组蛋白A琼脂糖凝胶一步纯化,很好用,当然你也可以考虑用疏水去纯化.白蛋白也可以用镍琼脂糖凝胶柱去纯化.
前者是葡聚糖凝胶,后者是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合的凝胶,所以前者刚性差,不容易做高分辨率的小颗粒,而后面的可以,刚性好,不容易因为pH,盐,压力而体积有很大的变化.
17)柱子一般寿命多久,保养好了能用四五年吗?每次上样量是否不得超过十分之一?用于装填柱子的reservoir在哪里买得到,中文名叫什么,不同规格柱子用的reservoir是否是一个规格?一般过一个柱洗脱液的流速控制在多少,大概需要洗脱液多少个柱体积,需要多长时间?
除了凝胶过滤需要严格装柱子,需要装柱器,别的柱子都不用,至于上样量也只有凝胶过滤也上样的体积有关,别的色谱都不需要遵守,一般是根据载量来上样,于体积关系不大,洗脱也看你挂东西的多少,一般3个柱床体积,多的要5个柱床体积,时间多少看你的流速和你的柱床体积. 18)凝胶过滤怎么脱盐啊,我做凝胶的时候buffer是甲酸铵,本身就是盐啊
过柱子,除盐没有什么难的,很难在这里把整个操作写一遍,甲酸胺是可挥发性的盐,你浓度不高,物质稳定的话,直接冷冻干燥,或者真空干燥都可以去掉了,没有必要过柱子,我猜测你的是多肽,过柱子也去不掉盐.
19)我提的蛋白中老是混有大量的血红蛋白,干扰实验的后续工作,非常苦恼.请问有没有那种介质可以吸附组织蛋白提取物中的血红蛋白?
20)我们的苯基琼脂糖凝胶可以吸附血红蛋白,而且很牢固,我们以前做过,你可以用这个办法去除, 在通常不加盐的情况下就可以吸附血红蛋白.
对这个填料不熟悉,没有用过,我觉得凝胶过滤相当于sephadex G-50,范围在1000-30000,但是它可用于纯化的蛋白量在30-200KD.
你是想用它做凝胶过滤还是离子交换呢,你为什么不用琼脂糖凝胶系列呢,这个填料在高盐的时候床体积变化很大,不好用.
离子交换试了四个月不行,最近一次错用成了含PO3-的缓冲液,结果还没有开始往上加NaCl梯度蛋白就下来了,后来查资料才知道PO3-会和DEAE反应,不知道是否因此使这个柱子的离子交换失效,变成单纯的凝胶过滤,所以想知道和它相当的Sephadex的型号.那何必呢,直接用凝胶过滤好了, sephadex G-50正好适合你的蛋白.
22)可是产品目录上说G-50分离范围是1000-5000,适用于脱盐,我的目的蛋白是18000啊.
23)我试做过两次CNBR活化亲合配基偶联,效果不太理想;希望能得到你的指点,听你说环氧活化琼脂糖凝胶有不少优点,请给一些活化及偶联的资料吧.
你偶联的是什么配基呢,环氧活化可以选择合适的亲和手臂,例如我们常用的有3-10个碳原子的手臂,而对于一些物质的纯化,没有手臂是不行的.此外环氧活化再偶联形成的键非常稳定不容易脱落,所以我们经常用这样的办法,我已经把我们的材料发给你了,其实这样活化的方法偶联的效率也很高,它还适合带氨基,羟基,巯基等配基的偶联,应用范围很广,我觉得是不错的方法.
国产的就很好,价格便宜,性能一点也不差于进口的,螯合好了镍离子,载量高.能少花钱的何必多花钱呢,其实所有这些厂家性能都差不多,没有太大差别.
你就选择卓冠科技有限公司的吧,没有必要选择进口的,你pM你的邮件地址给我.我可以把相关的材料发给你.25)我们实验室最近纯化了一批带His tag的蛋白,大部分为包涵体形式.用8M尿素超声溶解后,用amersham的镍柱纯化,结果均不是太纯.因为我的目的是想纯化后作为抗原做ELISA检测,为了防止与血清中的抗菌抗体起反应,必需得到很纯的蛋白.所以想请教一下还可以如何优化条件或结合哪些别的纯化手段?如果几种纯化方法联用的话,怎样的顺序最合理呢?
一般通过一步亲和都可以得到不错的效果,没有必要多做几步,何况包涵体的蛋白用别的纯化方法效果未必好, 洗脱用阶段洗脱的方法,摸细致点, 相信会有好的结果的,你把你的邮件告诉我,我把我们的材料发给你参考吧.
26)我提取了一些水溶性多糖,但含大量的色素.我想用筛或离子交换将色素与多糖分开,不知可行吗?色素会不会粘在填料上将填料污染?
27)我想纯化一蛋白,量10kd左右,目的蛋白来自血液中,浓度大概为每毫升20纳克左右,其他性质不详.手边暂时没有bio-rad蛋白质纯化用mini-protein电泳仪,无法用tricine-sds-page纯化.反相液相色谱柱c18又太贵,有没有其他比较好而且又经济的方案?谢谢.
28)你好, 我没做过层析,我想纯化经胃蛋白酶消化的血浆蛋白, 使产物F(ab)2含量达到80%以上. 现在的工艺F(ab)2含量在45-65% . 请教大规模层析方案. 一次处理量为100万毫升, 蛋白含量约2% .
我觉得可以在疏水和离子交换的办法中去试.你的样品中主要的杂质是白蛋白和IgG吧,你也可以把这些物质去掉达到去除杂质提高纯度的目的.
29)我想问一下C8柱用于分离蛋白质或肽类物质时,怎样选择洗脱的试剂?我对HPLC不懂,但现在需要用!谢谢!
你查一篇文献就知道了,比较简单,就是低浓度的乙腈水加三氟乙酸平衡柱子,然后在用高浓度的乙腈水加三氟乙酸线性剃度洗脱,基本就这样,具体的浓度要自己看你蛋白特性而调整了.不少HPLC的文献都有具体的方法. 30)今天花了一个晚上浏览,收获蛮大,我的问题是这样：纯化GST融合蛋白(加上GST共90kD多),用amersham的1ml柱,曾经纯化出来,但酶切后就不见目的蛋白,只见GST,这次更悬,没有加凝血酶切,但洗脱柱后就在GST大小附近有带,菌液预先小量有目的条带(90kD,没有GST条带),不知道是什么原因,条件：IPTG0.1mM,26～29度3小时.细菌离心后用PBS重悬,-80度反复冻融3次,蛋白酶剂只加了PMSF,超声(可能有点过,有部分泡沫),加tritonX100后RT摇20min,添加DTT至10mM(操作手册说可以增加跟柱的结合)后10000g离心,上清过柱按说明操作.SDS-PAGE的结果,沉淀仍然有大量目的条带,过柱前的上清的同一就只有很淡条带,过柱后相类似,PBS洗出液里蛋白就较稀少,但关键洗脱液中就只见约26kD的条带,怀疑GST,但从何而来?
我曾经按此步骤纯化过量比较小的一个蛋白(含GST约55kD),纯化得率还可以,但这次失败的原因是什么呢?
我怀疑是超声过了也许断裂了,所以这样,或者使蛋白变性都有可能,至于切了没有目标蛋白会不会切了以后不稳定,就沉淀在柱子上,这样就只有切的了,你可以用变性剂看看能不能洗下来东西.我想这是原因吧.
谢谢chromatography的,现在我已经决定不切除GST,凝血酶也很贵,不成功,则成#%￥,所以,应该GST对研究影响不大吧.
是不是融合蛋白在融合位点就特别脆弱呢?我添加的DTT是不是也有影响?怎样超声不会太过?我500ml菌液浓缩到15mlPBS,超声几次都还很粘稠,请再给予指点.
我不做上游,但是处理的时候,书上是写如果超声的强度过大,时间过长,有可能会变性或者断裂,加DTT有没有影响我不很清楚,预处理这个问题你还是问问外面做表达和提取的人吧.变性剂常用的是尿素和盐酸胍
我现在用的凝胶柱是S-200,是不是不大合适?此外,做SDS-PAGE时,有一条杂蛋白,和我的目标蛋白距离很近,一直分不开.不知道该怎么办?
你纯化出来应该是不错的,因为这样你的目标蛋白正好在纯化范围外,至于很近的杂质有没有可能是降解的产物呢,其实你也可以用s-100试试.如果没有,那就用现在的吧
32)我在做一个核内定位的蛋白,预测等电点是10,60KD.做过好久的亲和纯化,有N端his-tag,C端his-tag, 还有N端GST-tag的,纯化时的问题都一样：包涵体表达为主,上清含量很少.用低离子强度的PBS破菌的化,上清中含量会多一些,但是蛋白不挂亲和柱.洗脱出来的微量目的蛋白中目标蛋白只占很少一部分,用透析,PEG浓缩等等操作又都能使蛋白完全沉淀.上清用硫酸铵沉淀浓缩以后过疏水柱也不挂,也试过阴、阳离子柱,还是不挂柱.因为蛋白活性未知,所以我不倾向于做包涵体纯化,但是也曾经试过分级洗涤提包涵体蛋白,都没能拿到比较纯的包涵体,而且在包涵体中his-tag耦连的该蛋白也不挂柱,很,在变性条件下不应该存在tag被蛋白屏蔽的问题吧?
既然是包涵体本身应该有一定的纯度,不挂柱,那你用的是哪家的产品呢,此外怎么操作呢,你能说详细点吗,有的时候也许结合力比较弱,所以要选择镍密度高的填料,延长作用时间,提高pH值,降低流速,一般天然结构不挂的时候有,但是变性不挂很难理解,此外你的样品里有没有别的物质干扰挂柱,原因挺多的,所以需要你说详细点.
我用的亲和柱是qiageon的Ni-NTA agrose,应该不是镍柱质量问题,用这套操作体系纯化过几个其他his-蛋白效果都很理想,至于是不是有其他物质干扰我也不能确定,但是我试过这么多载体和tag,效果都一样,就觉得是蛋白本身性质的问题了
据说在靠近等电点附近的ph条件下,8M尿素体系的his蛋白是不挂柱的,不知是不是有这个情况,但是据预测的数据来看,好像ph8.0的缓冲体系应该不存在这个问题的
至于操作呢,亲和纯化我们用的都是agrose,在离心管里agrose与菌体上清度或者室温结合2hr～过夜不等,结合条件应该是很充分的了,很
另外如果是86KD的蛋白与其他60KD以下的杂带分开的话,用哪种型号的筛来做HPLC合适呢?
做HPLC的话那你可以用TSK系列的凝胶柱,不过处理不了多少样品,虽然每家都产镍柱,他们的产品其实结构是不一样的,而效果也会有一些差别,因此我你可以换一种填料试试,没有听说哪家的填料是最好的,我没有用过这个公司的填料,但是它的结构我很清楚,我个人感觉这个填料的吸附力是比较弱的,因为我看过一般洗脱通常在200-300uM咪唑之间,而且由于它的填料结构是有三个螯合基团螯合镍离子,而通常用的只有两个,这样剩余用在和his作用的镍离子的价数就少一个,这样必然会吸附力不如只有两个的,这是我个人的见解.我用的填料有不少洗脱要在300-400mM咪唑,可见作用力还是有差别的,结构也是有差别的,这些差别和琼脂糖没有关系,只和配基本身的结构有关.
如果你说的pH的问题,那你可以再提高pH看看,反正是变性的,无所谓,你提高的10或者10.5看看,也许这样能挂住.
此外你也可以考虑换个别的离子看看能不能挂柱,不过好象你的填料也没有办法换离子,这个也是它的缺陷.
33)我用离子层析得到人总IgG,含有IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,然后用亲和层析获得各个亚类,它们的量分别为：146,146,170,146,量差别很小,用常规的SDS-PAGE+考马斯亮兰很难鉴定它们的纯度,请问用何方法来鉴定它们的各自纯度.
哦,什么亲和能把这几个亚类分开,我记得好象说只有羟基磷灰石能把一些亚类分开,至于鉴别我没有做过,我觉得只能用专门检测亚型的试剂盒去检测他们了.
34)请问：DEAE-和CM-纤维素柱用完后可以用20%的酒精过柱保存吗?或用1M醋酸钠 pH3.0?
应该可以用20%乙醇保存,就是柱子中填料也许会缩小一些,用醋酸钠也需要加防腐剂例如叠氮钠等把,否则也会长菌的.
上样的浓度应该关系不大,只和上样的总蛋白量有关,你可以查他们的载量,我觉得一般的离子交换填料的上样量也就在>20mg/ml左右,太高我没有上过.
变性的蛋白既然能免疫,那么直接偶联到填料上做成柱子来纯化你的抗体应该没有问题,但是变性后的蛋白偶联很麻烦,因为如果你的变性蛋白要在盐酸胍或者脲里溶液,那它们都有氨基也许也会和活化的填料偶联,所以你的蛋白在普通缓冲液中能溶解才成.考染后的蛋白估计是不适合做抗体的配基,你可以跑电泳只切一条染色,这样知道后再把剩下电泳板切胶电洗脱就可以.我没有做过这个实验,所以抱歉,你可以在DXY里搜索,你会找到电洗脱的一些帖子的.
36)请问chromatography : 我用QIAGEN公司的Ni-NTA纯化his tag 融合蛋白,杂带忒多,摸过很多条件,做过很多不同的蛋白,结果都一样.能否麻烦老兄寄一份his纯化的资料让我好好学习学习.
我已经把材料发给你了,你可以参考一下,或者改用我们公司的镍琼脂糖凝胶试试.去除这些杂带一般可以用降低pH洗脱,同时在缓冲液里加一些非离子表面活性剂,这样可以降低非吸附.
37)你好版主!我想请教一个问题：8M尿素溶解的蛋白能否直接做疏水或凝胶层析?另外separose 4FF分离2万左右量的蛋白效果会如何?如果改成 6FF应该怎样换介质?
8M尿素溶解的蛋白不加盐的话估计是挂不住的,你可以降低一点脲的浓度,这样才能硫酸铵能溶解在这里面.做凝胶过滤得小心点,在变性的条件下,蛋白都是线性,凝胶过滤是很难分开的.用separose系列分离这么小的效果也不会好的,除非是差别很大,即使separose6FF也未必好用. 38)请问chromatography 师兄, 纯化his蛋白,用降低pH洗脱和梯度咪唑洗脱有什么不同吗? 梯度ph洗难道不会使蛋白变性吗?
低pH和咪唑不一样,降低pH可以减弱蛋白和金属离子的作用离,这样吸附弱的蛋白容易被洗脱,而咪唑是竞争洗脱,它们原理是不同的,互相配合可以使一些咪唑洗不去的杂带洗掉,低pH也就到4-5左右,短时间不少蛋白不会变性的.
39)偶纯化一个原核表达的热休克蛋白融合蛋白,超声裂菌后40%硫酸铵沉淀,然后DEAE Sepharose FF纯化下来纯度85%左右,有3条杂带,分别为130KD+、～55KD、～45KD,目标蛋白量为74KD,偶的要求是要达到电泳纯所以偶选了phenyl做进一步纯化,可是偶的这个蛋白比较奇怪2M NaCl才能挂柱,(用硫酸铵的话还没挂柱就沉淀了),可是挂上之后0M NaCl也洗不下来,而且杂蛋白的性质和目标蛋白很象也弄不下来,是不是偶的疏水做的有问题呀?还有一个问题就是国产的柱子和仪器哪家的比较好?我现在用的柱子没有接头,对拉梯度会不会有很大影响?
其实你这个操作我觉得你可以这样,沉淀后直接上疏水,然后再过离子交换,至于你说的沉淀你可以稀释到低一些的硫酸铵蛋白就不沉淀了,它不需要那么高的浓度,一般1.5M左右看有没有沉淀,能不能挂在柱子上,洗脱洗不下来可以在洗脱液体中加5-10%的甘油或者乙二醇,应该和你操作没有关系.
国产的机器和柱子上海就有,上海沪西的就不错,柱子一般用锦华的.如果你的柱子没有死体积就没有关系.
我之所以不先用疏水是因为疏水的分离效果很差,下来后还有好多杂蛋白,不如DEAE效果好,我现在用DEAE纯度可以达到85%,但是下一步不知道选什么介质好了,疏水不是很理想,我刚才用2M NaCl上样,用500mM NaCl到0M NaCl 50%乙二醇的梯度洗脱,结果都洗不下来像样的峰,是一个扁扁的A280最高值才7,偶用的柱子是1X17cm,流速0.9ml/min,洗脱体积>10CV.还有不知道Butyl、OCtyl和phenyl差别大不大,如果换他们两个会不会有不同效果?还有偶的蛋白是个多聚体,凝胶过滤好像没甚么戏.不知道您还有什么推荐的介质供选择吗?偶的蛋白不怕变性.
是吗,那会不会你的蛋白再盐情况下容易沉淀,所以没有没有得到象样的峰呢,如果是这样你可以降低浓度,调pH看看,我怀疑是沉淀到柱子上,或者你用盐酸胍洗看看,通过调pH可以改变溶解度,此外可以用凝胶过滤做试试,或者尝试燃料亲和或金属螯合试试,也可以用羟基磷灰石做试试
40)chromatography :您好,我想请教一个问题,我要把标记碘的900KB的蛋白与游离碘分开,用凝胶层析法,应该用多长的柱子及多大型号的凝胶呢?
游离的碘是溶解状态的吗,这个我不清楚,如果是小的,那可以透析或者sephadex G-25柱子就可以,你试试吧,不知道你处理多少体积,一般上样量是柱子体积的1/5或1/4
游离的碘是溶解状态,我用过sephadex G-200,分离效果很差,昨天刚用过sephadex G-25,效果也不好,第一个峰下降的不快,并且两个峰之间的值仍然很大,远远大于本底值,我用的柱床体积是18立方厘米,每次上样量只有100微升.您看我哪个地方需要改进?谢谢!
41)chromatography,你好.我现在遇到一个非常头痛的事情,最近用筛SephadexG100来分离虾的总蛋白的时候可以把大和小蛋白分开,可是条件不变,换了蟹的材料就不行了,而且提高盐的浓度或PH值都没有使分离效果得到改善.请帮忙分析一下.分离条件如下：柱体积为80ml,流速为0.1ml/min,上样方式手工上样,缓冲液：0.05M磷酸缓冲液,PH=6.4.分离图谱和SDS电泳结果见附件.请问如果换一种孔径的筛是否能够使蟹总蛋白分离效果改善?如果是应该换大的还是小孔径的?您还有其他好的吗?谢谢了!
要把大蛋白和小蛋白分开,那你干脆选择范围更小点的填料,例如G-50也许更好点,此外对凝胶过滤改变pH和盐对分离效果没有什么影响.你的流速也太慢了,可以提高到0.5ml/min左右.抱歉忽略了,以为已经回复过了呢.
42)还有一个问题想问一下.纯化的酶最终要冻干成制剂,静脉注射.可是内毒素很难合格,好不容易成功过几次,现在又不行了.而且我用的TRITON X-114萃取分离不适合放大.该酶理论等电点8.4.ph稳定范围7-11.肯定不能用阳离子柱了.内毒素合格标准每mg小于25EU.请问可以用什么方法,或者什么填料?哪可以提供少量填料小试一下(我们公司只有看到可行才会买大量柱料)?
2 配制缓冲液的盐类必须保持不被内毒素污染.所用蒸馏水应该新鲜配制,所用试剂也最好新鲜配制,因为缓冲液在常温下很容易孳生细菌,而是溶液产生大量的内毒素.
你的酶是不是有同工酶,这酶有什么特点,需要辅酶吗,不知道有没有试过疏水,此外也可以用染料亲和的方法,不知道有没有可能用亲和的办法.
萃取的方法回收率要低,而且如果临床那也得对你的的TRITON残留也是个问题,不好去干净.我们有专门去除内毒素的填料,可以给你点小样,你可以PM你的邮件给我,我把我们的材料发给你.我们是用亲和的方法,去除内毒素,收率高.你可以试试.
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