1)问一个有关DEAE Sephadex A 50的问题,我的填料处理好后别人拿去用了,用了一次,结果我把他放到烧杯后,发觉已成絮状,不知有没有坏掉?可以再用吗?用什么方法可以把它恢复到原状?
这个絮状的东西有颜色吗,会不会是染菌了,或者是脏的东西没有处理干净,你可以用0.5MNaoH泡半小时,沉淀后倾去上清,做三次这样的处理,如果还有不干净的东西,你可以用6M盐酸胍泡半个小时,然后处理和NaoH一样,再换水,这样你看能不能洗回来,如果不能很好沉淀下来,那就不能用了.凝胶类的填料很容易长菌,用完得洗干净,保存在20%的乙醇中.
其次,我想问一下你纯化过GST融合蛋白没有?我现纯化一个融合蛋白(某种酶和GST融合),我买了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升,但我不知怎么做.克隆说直接将亲和介质于细菌裂解液混允离心....我不知我买的可不可以这样做.而产品说明书上说做柱子,我就想1毫升的柱子怎么做,装介质的柱子的高度和直径有要求吗?
GST融合蛋白纯化过,5ml的凝胶你可以装在1.6x20的柱子上用,也可以按照克隆的做法做,取决于你的喜好和方便.1ml不好装,除非有专门的小柱子,对于直径和高度没有特别的要求,我们的做法是：
6、 用纯水洗5个柱床体积,再用20%的乙醇洗5个柱床体积,流速为1ml/min,柱子置于+4~8℃中保存缓冲液组成：
4) 谢谢,我想问一下,是不是离子交换必须要线形梯度洗脱比较好呢?还是阶段洗脱好?检测器我想先收集然后再去测紫外.
也不是,有的时候阶段洗脱效果就很好,而且容易放大,不需要仪器,我比较喜欢,效果差不多,但是很省事.但是关键是容易重复.紫外分管测定那也可以,我上学也那样做过.
5) 我要从总蛋白中提出250KD的NF1蛋白做western,由于量少所以要做免疫沉淀.我是利用小鼠来源的NF1单抗与兔抗小鼠IgG、protein A-sepharose来做免疫沉淀,发现做完后跑电泳,出现了两条带,分别位于85KD、55KD左右,请问这会是什么东西?会是抗体吗?还有没有可能是目标蛋白变小了?
抱歉,我没有做过免疫沉淀,但是抗体做过一些,抗体重链没有大到85KD的地步,所以应该不是抗体.会不会你的蛋白有四个部分构成,分别是两个85KD和55KD,这样量正好和你的250KD相当,你可以跑非还原电泳看看,是不是还这样呢.如果不是,那说明是由这两个部分组成的.都是由二硫键连接的. 6) 我提胰蛋白酶,主要参考用张龙翔书里的办法,先提卵类粘蛋白,首先过SEPHADEX G-25 柱子脱盐,然后过DEAE纤维素离子交换柱;第二步是用卵类粘蛋白合成SEPHAROSE-4B亲和柱.这些层析过程都可以在缓冲液里面加0.02%的叠氮化钠抑菌吗?以后怎样去除?
那实验我知道,你用什么方法活化琼脂糖呢,胰蛋酶的亲和纯化方法很多,配基有大豆胰蛋白酶剂,抑肽酶,苯甲脒类,特别是后面的苯甲脒,可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶,何必自己去提取呢,感觉比较复杂,自己偶联这些配基也可以,层析过程不需要加0.02%的叠氮化钠抑菌,尽量不要加,那透析或者除盐柱子都可以,或者直接上一样的亲和柱子,用不含这个的缓冲液洗,最后洗脱下来就可以了.
最好还是用乙醇,浓度很难说,因为和你的蛋白浓度有关,别的醇用得很少.此外你可以考虑用硫酸铵沉淀,这样对活性更好些.纯化也可以用疏水,因为它在苯基琼脂糖凝胶柱子上能被吸附,配合硫酸铵沉淀也是不错的选择.
7)楼主,我想问一下phenyl-sepharose CL-4B有没有浓缩作用,以前有人做过,克也在纯化时,浓缩5-10倍,可是,我却没有使纯化的蛋白浓缩,我想得到浓度较高的蛋白,又想省去浓缩这步,楼主能不能指点我一下,缓冲液的流速以及柱子的选择上有什么要求,使洗脱下来的蛋白浓度会较高,
亲和,疏水,离子交换都可以浓缩样品,但是离子交换是最便宜的,苯基可以浓缩,但是想有好的浓缩效果,最好用一次洗脱或者阶段洗脱的方法,我你先用离子交换柱子挂住,然后直接用高盐洗脱,因为不知道你蛋白的等电点,所以不知道你该选什么柱子.如果样品含盐高,那可以用疏水,然后直接用缓冲液洗脱就可以.亲和也差不多这样的.流速没有太大的要求,柱子看你手头有什么,离子交换是最常用的.上点样
8) 我做的是青霉素酰化酶,样品盐浓度很高,我是两步纯化,第一步使用氧化铝物理吸附,使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸铵的ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗脱的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脱盐和浓缩,可是效果很差,基本是起不到浓缩的作用.
我做了好几次,都是这样,可是前面有人做的时候起到浓缩的作用,我现在却做不出来,也联系不上以前做过的人.
phenyl-sepharose CL-4B使疏水层析,我现在就这种柱子,我想问的是装填料的时候用的玻璃柱株高和直径的比值大的还是小的,洗脱蛋白时会使洗脱的蛋白峰值高一些,谢谢
这个酶纯化应该可以用亲和的方法做吧,其实只要把青霉素G偶联到琼脂糖凝胶上就可以用于这个酶的纯化.苯基琼脂糖凝胶浓缩可以,但是除盐不好,你想浓缩效果好,你可以把硫酸铵的浓度提高到2.5M再挂在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸缓冲液洗就应该可以.你想浓缩的效果好,那尽量用短粗柱子,也就是径高比大的柱子.这样扩散少些.此外要用高载量的填料,颗粒细点,起始盐浓度高点,这样能浓缩好你的样品.
9) 楼主：这段在用离子交换柱过抗体,请问抗体的吸收图谱是怎样的?它的特征吸收峰在哪里,不同的多克隆抗体是不是还有自己的特征吸收峰,
抱歉,你是说色谱图还是紫外吸收图呢,蛋白一般都是在280检测的呀,不同的的蛋白虽然有一点差别,但是那也不是很明显的,其实就用280就可以了.
10)我的蛋白以GST融合蛋白的形式表达在E Coli中,量14~15kDa,蛋白的疏水性很强,等电点在7左右.菌破碎后,用表面活性剂提取的融合蛋白,据文献说是由于此蛋白和细胞膜结合,所以如果不加表面活性剂,上清中电泳检测不到.加表面活性剂后,提取效率还可以.上GST 胶.开始时采用先洗脱融合蛋白,再酶切,洗脱采用10mM GSH洗脱,没有加表面活性剂.然后酶切后,就会产生大量沉淀,上清中没有目的蛋白.后来在酶切buffer中也加表面活性剂,就得到了改善,没有再出现沉淀,目的蛋白也存在于上清中.目的蛋白中仅有一个cys.
1、老板不知从那看了篇文献,是专门讲此蛋白的结构的.不过人家的蛋白是合成出来的,然后用反相C18(300A孔径)分离的.他非要我不上GST胶(因为binding 效率不是很高,GST价格很贵,工业化好像也没几家),提取液先酶切,沉淀后离心上反相分离.我觉得沉淀中的杂质组成不很清楚,如果有大一点的蛋白变性沉淀之类,用反相会不会很容易堵柱子?我看一些资料,反相只用来分离或分析短肽,较少用于分离较大的蛋白,尤其是我的杂质都不清楚的情况下.
2、过去曾做过superdex200 10/300分离酶切产物时,由于目的蛋白聚集,我也没有marker,每个峰较难定性,电泳看不出来,可能是浓度太低.我想用反相有没有可能建立一种便捷的分析方法来分析纯化过程中目的蛋白的量?
3、我的蛋白酶什么好的测活方法,只能做细胞毒性试验.有一篇文献说在生理条件下,我的蛋白没有二级结构,尽管在一定浓度下未沉淀,但是都以多聚体存在,如果加入50% TFE(三氟乙醇,trifluorethanol),则可使其在中性pH下恢复二级结构,此时大部分以二聚体存在.那么,你用过TFE防止聚集么?这样做有什么根据么?好象一般都只用表面活性剂(对细胞有毒性),或L-arg,PEG之类的,可我没找到在L-arg和PEG存在下,目的蛋白的结构功能方面的文献.现在不清楚多聚体是否就一定没有活性?郁闷阿,望多多指教!
4、我的GST结合效率不很高,总有部分流穿(应该没有超过载量),而放慢流速改观也不明显,后来结合的时候binding buffer中也加表面活性剂稍微好一点,但还是不满意.我曾试过把流穿收集再进GST柱,可是几乎不结合,所以我怀疑GST部分可能有变性和不变性两部分.我曾看过一文章,提取时采用离子型表面活性剂,binding时在加入triton X-100,采用混合表面活性剂,据说可以使GST部分复性,增加binding,我还没有试过.
1,其实反相价格会更好点,因为有机器,柱子和流动相也不便宜,其实我们用的是国产的GST融合蛋白的纯化系统,价格就不贵,你PM你的邮件给我,我给你一份材料,反相柱子其实做不了多少东西,所以你别用它制备.
2.只要你有标准蛋白,那用HPLC做分析代替电泳是很不错的,因为这样时间缩短了,效率更高,而且定量很准确.
3.三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
4.至于你柱子挂得少,那有可能是因为有些目标蛋白的结构和能挂上的不一样,那你可以试试降低上样的浓度,包括降低疏水性,加表面活性剂看看,这个不做怕是不知道的,因为只要GST没有活性或被屏蔽,那肯定挂不上.
11) 色谱兄能否推荐几种不错的离子交换介质呢?我现在知道有羧甲基纤维素,sp-sepharose等,但是砝码西亚的sp-sepharose太贵了,450/25ml.你能推荐一下比较不错的介质吗?物美价廉的,谢谢!
二是我现在有个GST融合蛋白,用thrombin酶切后的目的蛋白条带很弱,请问可能是什么原因有什么办决
还真没有做过,你可以用电洗脱的方法,然后浓缩可以用离子交换不就行了或者透析袋加PEG8000浓缩,只怕这样会变性了.
你酶切带弱,那可以尝试增加酶的量,或延长酶切时间,.此外看有pH有没有问题,你的蛋白浓度是不是太低.
完全没有问题,我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐,也纯化过,这样可以把很多小的蛋白去除,再过离子交换就可以比较纯了病毒.病毒都可以,那大的蛋白也没有问题,包括质粒也可以用凝胶过滤纯化. 14)谢谢chromatography的答复.介质有现成的,但很贵啊.我要分离谷胱甘肽还原酶,文献都是用2,5-ADP-Sepharose 4B纯化,以后你多留意点,
别客气,我的意思是你用兰色琼脂糖凝胶试试,此外有谷胱甘肽琼脂糖,应该也可以用来纯化谷胱甘肽还原酶吧,或者专门合成一个类似底物的也可以,其实你完全可以自己合成填料的.也许这样能很好地解决你纯化的问题.
15) 我用环氧氯丙烷活化琼脂糖,到哪儿可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶?GOOGLE 搜不到.我们没冷室,层析过程加什么来抑菌?我将层析柱放冰箱里层析以防长菌和防酶降解,可以吗?
环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢,我有国产甲脒琼脂糖凝胶的材料,你pM你的邮件,我把材料发给你,层析过程水是流动的,所以不会长菌,不需要抑菌,层析柱灌满20%的乙醇,放在冰箱4度中保存很久都没有问题.
16)查尔酮合成酶的酶活要用同位素方法测定,而我的条件没办法测所以需要送到别的地方测.这会造成很大的麻烦,请问chromatography 有没有人做过的,有没有好的方法可以借鉴?另外一个问题是：利用分离纯化这个蛋白的填料中有没有亲和偶联剂?我一直都没有查到过.
这个酶应该和查尔酮以及苯基酮都有的亲和力,你完全可以自己合成一些亲和填料,我们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质,效果不错,我觉得你可以用亲和的办法,即使是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个蛋白.因为它和芳香环有很亲和力.
17) 请问,如果所提蛋白质浓度低,如何进行浓缩或纯化.我试过丙酮沉淀法,但沉淀很难溶解,没法往下作了.有没有更好的方法?谢谢!
那你直接把你的样品放在透析袋中,然后在外面用PEG8000粉末浓缩,这样就好了,你也可以超滤浓缩.丙酮沉淀要在低温搅拌情况下缓慢加冷丙酮,避免局部浓度过高,此外沉淀后马上离心,这样也可以避免变性而不溶解.
18) 三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
1.TFE能稳定a-helix的形成,及这个蛋白本来就是a-helix的结构,但是由于dynamic太严重了,或其他的因素,造成表观上看不见.加入TFE能够稳定之,使之表观可见,用CD啊什么可以看得到.
具体的原理我就没仔细读了,不过这两方都有一定的文献证明,现在还不知道谁对! ^_^ 19)我是需要在兔肝中纯化一种酶,而且我是刚刚接触蛋白纯化我有几个问题想请教:
1 : 我的目的蛋白在强阴离子柱上结合(buffer : 25 mM 磷酸盐 PH 7.4),但是似乎结合力很弱(因为上样时就有少量蛋白flowthrough,而且洗脱峰在电导值刚开始升高时就开始出现了),我换用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后,蛋白的结合力好像还是很弱,洗脱峰没多大改变.请问我用 PH 8.5 Tris buffer 会改善我的问题么?
2: 由于目的蛋白丰度低易失活,而且实验室浓缩的条件有限,我过了脱盐柱和粒子柱后样品蛋白含量低体积大,我想请教:我接下来大体积上疏水柱能行么?会很大的影响我的分辨率么?我的蛋白在疏水柱上结合力很强,总是到梯度最末才洗出来,我该怎样优化一下?
3:我有亲和胶(red A) ,但是由于经济上的原因不能用的含配体的溶液洗脱,只好用高盐的洗脱液(含2M KCl),这样是不是分离效果很差?值得我去用梯度洗脱么?(因为我没有空柱,上不了机器,只能用手工做,这样做梯度很是麻烦)
4:天然的肝脏匀浆梯度离心后,在PH 7.4 的磷酸盐平衡液下,为什么绝大部分(95%以上)蛋白都结合不上去呢?我最好要把PH值降到多少去试?6.8合适么?
1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子,同时pH调为8.5,这样可能会好些,此外如果还是很弱,那你可以用Q柱试试.提高pH应该有用,但是有的蛋白吸附力弱,所以盐一高挂不住,因此要降低到5-10mM也许能更好点.
2.大体积直接上疏水没有问题,既然你的目标蛋白是最后出来,那你可以用0.5-1M盐洗去杂质,然后用0.1M洗脱,根本不需要走梯度,这样快,分离效果也不差,而且这样洗脱的体积小,容易放大.
3.你说的Red A 是procion red HE-3B吗,是染料亲和吗,既然这个填料可以,那么蓝色琼脂糖凝胶也可以,它们都属于染料亲和,这个应该更便宜点,洗脱用盐没有关系,不需要竞争洗脱,何况那样染料很难去干净.手工洗脱,你可以用阶段洗脱的方法,如你用0.5,1,1.5,2M的盐阶段洗脱就可以,不需要走梯度,只要你多摸索,你会找到个合适的浓度,效果一样很好,没有问题.
4.挂不上你是指的亲和还是离子交换呢,我想如果是亲和,那你可以降低pH,同时还一个缓冲体系,我觉得主要在pH,你降低到4-5那挂得就比较好一些吧.
2.那它的结构和我说的那个染料是一样的吗,你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶,都是颜料,结构也相似.
4.AKTA就是那样的,因为梯度是从一开始就算,而电导至少要近一个柱床体积才有变化,所以稍迟.
21) 你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱,此外其实你的蛋白量很小,杂质应该大多量比它大,你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来,或者上superdex 30 大于10KD的先出来,而你要的在后面,然后你再用离子交换试试,S-100分离范围比较宽,去杂质没有前面说的那两种好,此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住,因为这样小的盐会和蛋白一起出来的,你测定样品的电导看看.
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单,一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白,你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以,到一定的浓度离心沉淀,上清继续加硫酸铵,再离心,上清再加硫酸铵,你可以设计你的实验,然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果.
多谢你的回复,但是我把缓冲液PH 调到5.6,我的目的蛋白仍挂不上 SP柱(我是一个新手,正在做蛋白纯化.我的目的蛋白是以可溶形式表达,MW=6KD,理论等电点为9.45.,无tag.我先用S-100除去了部分杂蛋白,但接着再用阳离子交换柱SP分离(20mM PB ph=7.00),发现目的蛋白根本挂不上.),是不是理论IP与实际有相差?22) 有可能还在柱子上,如果你所有的组分都检测了没有活性,那这样的可能性很大,你可以用0.5,1M的NaCl分别洗脱,再测定这两个洗脱组分的活性看看.你的酶稳定吗.
23) 问一个可能是比较业余的问题,现在我想通过真核表到得到纯的蛋白,然后打单抗,但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化,很多人都这样说,所以科室里就没有人去试,实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径,所以想问一下,怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来,谢谢.
24) 多谢你的回复,但是我把缓冲液PH 调到5.6,我的目的蛋白仍挂不上 SP柱(我是一个新手,正在做蛋白纯化.我的目的蛋白是以可溶形式表达,MW=6KD,理论等电点为9.45.,无tag.我先用S-100除去了部分杂蛋白,但接着再用阳离子交换柱SP分离(20mM PB ph=7.00),发现目的蛋白根本挂不上.),是不是理论IP与实际有相差?
25)我的酶还算比较稳定,4C下活性至少三天不,也有报道一周不改变,-20C时间就更长了.
我分别用了0.5M,1M的NaCl洗柱子,测蛋白浓度还是很低,中间有几个管浓度较高,然后测酶活却发现活性依然很低,上柱前测的还有441IU/10ul,而收集管里的顶多只有20IU/50ul.
所以,我很怀疑它到底挂在柱子上没有,于是我检测了一下上柱后用初始缓冲液洗脱下来的收集液,发现酶活居然有100IU/50ul,我想是不是初始缓冲液的离子强度就太高了呢,0.011M柠檬酸-氢氧化钠,PH5.5?然后就用的是手工步进式洗脱,0.05M,0.1M,0.15M,0.2M,0.25MNaCl,直到后来的0.5M,1M.
阳离子层析柱用完后如何保存?先用1M氢氧化钠溶液,然后再用含硫柳汞的缓冲液,行吗?可不可以用其他的防腐剂呢?如有,可否推荐一下?硫柳汞我这里包装大,25g,又不能分装,需要避光保存,先谢谢了!
那用更高点的盐洗脱看看,例如2M,如果还是没有下来,那也许是沉淀在柱子上了,可是如果吸附,你的穿透应该活性很小才是,可是穿透好象有不少,是不是没有挂住呢.
26)问一个可能是比较业余的问题,现在我想通过真核表到得到纯的蛋白,然后打单抗,但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化,很多人都这样说,所以科室里就没有人去试,实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径,所以想问一下,怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来,谢谢.
纯化和表达系统有一些关系,但是最重要的还是看蛋白的特性,所以不一定真核就不好纯化,所以我觉得不用担心.纯化的方法你可以用离子交换等纯化方法,具体很难说,得看你的目标蛋白而定.
27) 你好,我想请教一下,我现在在做包涵体蛋白的柱上复性和纯化,是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸铵的浓度在1.75M以上,但是高浓度的硫酸铵在6M的盐酸胍中不能溶解,不知道你是否碰到过这类问题.而且我的蛋白又不能用8M的尿素溶解.缓冲液现在用的是50mM的磷酸二氢钠,PH7.5.还想请教一下,上样的浓度有要求么?不知道你有什么好的呢,谢谢.
要复性你的蛋白浓度就不能高,这样你溶解你的目标蛋白也就不需要那么高的盐酸胍了,这样你就可以把盐浓度提高点.上样浓度应该小于0.1mg/ml,具体情况得看你的蛋白,我你可以用简单点的稀释复性或者透析试试,如果不是特别复杂的复性最好能用简单的方法,别过柱子.
另外,我还想问一下“交换纤维素解离基团的pK值”?,“用阴离子交换纤维素时要选用低于pK值的缓冲液,用阳离子交换纤维素时要选用高于pK值的缓冲液.”是什么意思,谢谢!
所谓穿透就是上样后用及平衡缓冲液洗下来没有被吸附的部分叫穿透,pK值用于表示酸碱性的强弱,阴离子交换的填料是碱性的,所以你需要用用缓冲液pH小于pK值这样它才能带正电荷,用于交换带负电荷的样品,否则就挂不上样品.而阳离子是需要缓冲液pH高于pK值,这样它才能解离带负电荷,用于吸附带正电荷的样品.否则也挂不住.
29) 我做得GST融合纯化,目的蛋白在66KD附近,但每次纯化出来的总有杂带,特别是最近的一条带,浓度较大,不论降温还是改变剂浓度始终去不掉,您有什么高见,谢谢.
30) 向您请教一个问题,我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)表达目的蛋白,目的蛋白的两端都带His-tag,蛋白的大小为37kD,在利用Ni-NTA纯化时总是在目的蛋白带旁边伴随一条带去除不了,请问有什么高招可以解决这个问题?!!!此外,该表达产物为包涵体,请问这种产物可不可以直接用来制备抗体?谢谢!!!
也许这两个都是你要的目标蛋白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB看看是不是这样的,如果是,那说明是这样的情况.此外你可以再平衡缓冲液中加0.5%的吐温等表面活性剂,这样可以去除一些非吸附,此外你可以用pH45左右的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质,最后在用咪唑溶液洗脱.如果你这样都去不掉,而做WB也有两条带,那说明可能是降解,超声破碎的时候功率别太大,时间也别太长,注意温度,因为超声有时候也可能会使蛋白降解.
31) 我做得GST融合纯化,目的蛋白在66KD附近,但每次纯化出来的总有杂带,特别是最近的一条带,浓度较大,不论降温还是改变剂浓度始终去不掉,您有什么高见,谢谢.
你可以在你的平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl,这样可以降低一些因为离子作用带来的非吸附.同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂,这样是不是有点改善,此外你也可以用阶段洗脱的方法,例如用5mM和10mM还原谷胱甘肽去分别去洗脱,这样看看有没有什么区别.此外还要注意的问题是超声破碎时注意功率和时间.避免过强时间过长,降解蛋白.
此外你可以GST抗体做WB看是不两个都是你要的东西,会不会是降解或造成这样的结果.你可以加点酶的剂,此外抱歉我不是主任,嘿嘿.
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