(1)预先以缓冲液buffer A-150 平衡好,并且使完全沈降后的胶体体积,占全部体积的七至八成;要先预估好胶体的使用量.
(3)Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力,因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非性吸附.
(1)以纯水冲洗玻璃管柱(以纯水上下冲洗即可,严禁使用试管刷);并了解管柱的构造与拆装方法,垂直架好管柱,以软管连接分划收集器,并以 bufferA-150 试是否通畅;可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管,则可控制溶离的进行. 注意系统的摆设要适当,不要装置于交通要冲.
(2)依预估量取出Sephacryl 胶体,注意胶体的温度与缓冲液是否一致;将瓶中的胶体上下震荡,使其完全悬浮,但勿产生太多气泡.
(3)在管柱内加入约10 cm 高缓冲液,然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱,一直加到管柱顶端,开始流洗后胶体沉降很快.当胶体上方的液面逐渐降低时,可于顶端添加胶体,以达所要高度;胶体高度约90 cm.
(4)胶体完全沉降后,小心以buffer A-150 加满管柱,关闭出口,装上顶端端盖并连通缓冲液瓶,打开出口以重力流洗. 调整缓冲液瓶高度,使流速约每五~六秒一滴,并设定收集体积为2.5 mL/tube.
(5)胶柱流洗约100 mL 后,关闭出口,拆开顶端端盖,先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1 cm 高,注意勿胶体表面平整; 然后打开出口,使液面下降至胶体面,再关闭出口,准备注入样本.
(1)以微量移液器或滴管吸取样本 (样本体积不得超过胶体总体积的3%),沿着胶体上方管壁缓慢加入,注意切勿胶体的平整表面!(样本确实体积 _______ mL)
(2)打开出口,同时分划收集器;当样本完全没入胶体时,关闭出口,缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150,打开出口待其慢慢进入胶体中,如此重复二次.不得扰动胶体表面,造成凹陷.
(3)暂时关闭出口,将液面高度加满至管柱顶端,并把顶端端盖锁上;然后打开出口开始溶离,调整缓冲液瓶的高度,使流速为6 s 一滴.
(4)要留心观察前面几个分划,确定整个系统运转无碍,小心分划收集器最容易出问题.管柱预计将流洗过夜,收集约80 管.
(1)进行量测定前一天,请先以buffer A-150 流洗100 mL,并检查胶柱内有无气泡产生,若有严重的气泡或干裂,必须重新装填管柱.
(2)取标准量溶液0.4 mL,加上纯质目标酶0.5 mL (以亲和层析法所得的AF 部份),如上法注入管柱中,立刻开始进行胶体过滤,并收集各分划.请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点.
(3)收集所得的各分划,进行蛋白质定量分析,可定出数个蛋白质尖峰,以作为量依据;另以目测法,决定红色高峰的管数,则可定出vitamin B12的溶离管数.利用以上数据,可画出量与溶离管数间的直线关系,作为量判定的标准校正线)同样的一批分划,请进行酶活性分析 (GUS),则可定出酶的溶离体积,对照上述标准校正线,则可求出酶的量.
(1)若管柱长期不用,应当自管柱中取出胶体,以缓冲液清洗后,置冷藏室中保存,但绝对不要放在冷冻箱中.胶体若装填太紧,有时可能不易取出,要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来.
(2)胶体可以加0.01% NaN3防止霉菌生长,但使用前记得要洗去;再度使用时,请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒,若有结块而不易打散者,也不要使用.
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