λmax=560―590nm.染色灵敏度比氨基黑高5倍.尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色.但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律,用作定量分析时要注意这点.
又名Xylene brilliant cyaninG.比考马斯亮蓝R250多二个甲基.MW=854;λmax=590―610nm.染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色.所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析.
六孔板的一个孔加入100微升的裂解液为标准,根据面积来换算其他培养器皿所要加入裂解液的量.只做参考!
配制好的显影液是避光放置的(相信大家知道这点),而且配制好的显影液是不能和空气接触的,否则会很快发黄.我一般是一次配制1升的显影液,然后平均分为4份.把不用的3份装到容量小于250ml的棕色瓶中(盖盖子时刚好有多余的显影液溢出),封口胶封好再放置处.
这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同.SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会出来,裂解液变得很粘稠.NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以掉胞膜,而对核膜的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白.TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活).
跑PAGE电泳时,凝胶两边的孔道是不使用的,因为很多时候凝胶两边的孔道在凝聚的时候都会不均匀凝聚,导致电泳条带弯曲.
1.大蛋白跑的十分的慢,所以要确定分离胶的浓度不要大于8%,同时转膜的时间还要适当的延长;
2.大蛋白质很容易在凝胶里沉淀,阻碍转移.在转膜缓冲液中加入SDS可以大蛋白质沉淀,但甲醇会把SDS从蛋白质中脱离下来,所以降低转膜缓冲液中甲醇的含量有利于大蛋白质的转膜;
1.SDS会阻碍所有的蛋白质结合到膜上,而小蛋白质所受到的影响会比大蛋白质大,所以如果目的蛋白的量比较小的话,要考虑把SDS从转膜缓冲液中移除;
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