1)我准备用30%-60%硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl-sephorase柱.但发现活性大部分还在沉淀中.测了一下蛋白浓度是20mg/ml.是不是浓度太高啊?
30%-60%硫酸铵沉淀可能对你的目的蛋白来讲,太粗略了,如你所言,目的蛋白可能在沉淀中,可否分级沉淀,30%-50%,50%-60%,再测一下活性可能就分开了,20mg/ml的蛋白浓度对于层析是有点高,洗脱液浓度变化或PH的改变都会使蛋白失,最好不要超过10mg/ml.
2)我的蛋白是用pGEX-4T载体在BL21中表达的,表达量很高,形成包涵体,为了获得可溶性蛋白,我现在尝试用较低浓度的剂,此前用不同浓度做过对比,电泳后表达量的差异不大;但当我再降低温度后发现,超声处理后的上清液中目的蛋白条带很微弱,大部分目的蛋白还是在沉淀中;这和我降低剂前做的不一样(同温度),为什么目的蛋白的可溶表达会不稳定呢?对同一菌种应该是固定的吧?我很.
另外,请问,一般情况下28度,30度时间应该分别多少才合适?我们的光度计出了点问题,无法测定OD值.谢谢.
我们实验室有两种蛋白,一种等电点5左右,另一种等电点9左右,为什么都可以用CM阳离子交换纯化?(用的缓冲液都呈中性)
纯化是把目标蛋白和杂质分开就可以,所以其实在这样的情况下,酸性蛋白是挂在阴离子柱上,而后面的挂不住,但是只要能把它们和杂质分开就可以.所以酸性蛋白流穿,杂质被吸附也可以,所以不一定非要吸附也可以.
4)我准备用30%-60%硫酸铵沉淀透析、离心后去上phenyl-sephorase柱.但发现活性大部分还在沉淀中.测了一下蛋白浓度是20mg/ml.是不是浓度太高啊?
也不是,其实沉淀你可以做仔细点,例如先用30%沉淀,取上清,再把上清加到40%,然后如此类推,一直到60%,然后测定沉淀和最后上清的活性,这样就知道哪样的浓度沉淀效果比较好,既然你的活性都在沉淀里,那直接溶解在一定浓度的盐中,直接过滤上柱子就可以,浓度高也没有关系.
5)急问：我的样品蛋白液本来放在4C保存,谁知有人把温度调到了18C已有一天,请问这样对蛋白会有多大影响?我纯化的是一种酶.另外,树脂在这样的温度下性质会有所改变吗?某人说4C-30C的情况下,树脂不会有太大改变.是这样么?谢谢!
不知道你的蛋白稳定不稳定,你可以测定一下活性看看,如果没有什么变化,那就没有关系,树脂不会因为温度有什么变化的,尤其是你的树脂不是以蛋白为配基的亲和填料.,没错在4C-30C的情况下是没有多少改变,但是那也看多长时间,什么树脂,因为时间长会长菌如果不加抑菌措施的线)我用鼎国的sepharose 4-B 合成亲和柱可以吗?
是活化好的吗,还是普通的琼脂糖,他们的填料颗粒有的比较粗,不知道你选择的粒径是多少范围的,最好要细一些,45-165um比较好,用一般应该没有问题.
7)比如说,sephadex G-25的分级范围是1000～5000,我想问一下,量小于1000的(例如盐)是怎么样通过的?它是从凝胶内部通过吗?不是说只有1000～5000大小的从凝胶内部通过吗?
凝胶的中间有的是大小不同的孔,盐自然在这些孔中间通过,而所谓的分离范围也只是说在这样的范围内有差别,离开这个范围就没有分离效果,所以小的和大的都没有什么分离效果,因此不是只有1000～5000大小的从凝胶内部通过.而是在这个范围的有分离效果.
8)请教：要从发酵液中纯化出一个量约为1100的具有抗菌活性7肽,前期的提取采用的是酸沉醇提的方法,粗提物中蛋白含量39mg/ml.资料上说,纯化这个小肽要用sephadexLH-20,可是我没有.：(尝试用sephadax G15 进行了纯化,出现了五个没有分开的峰,第六个峰分的还算可以.考虑到可能是粗提物中的组分太多,于是对粗提物用sephadex G200进行了纯化,得到一个单一峰,收集后,冷冻干燥,再过sephadex G50,得到两个吸收峰,可是实验发现,这两个吸收峰没有抑菌活性了：(洗脱液用的是pH7.0的PBS,检测波长280nm.请问可能出现的问题有哪些?洗脱液选择的有问题?检测波长有问题?{我的这种多肽,资料上说HPLC的检测波长为210nm,也有205nm的.｝
你的问题很不明确,用sephadexLH-20纯化除了有一部分凝胶过滤外,还有一些分配色谱的作用,所以这个介质和sephadax G15 是不太一样的,你纯化出多少峰都应该进行抑菌实验,否则很难知道你要的组分在哪里.既然这个量这么小,那你上sephadex G200,估计你的目标多肽在最后面,所以你得到的那个峰不一定有你要的东西,而在后面,我是这样猜测的,关键你要测定活性,所以你再纯化也没有活性,问题在于你没有时时做活性检测,填料选择不很正确,检测波长我不清楚对不对,关键你要选择合适的柱子,同时每一步都做活性检测.
我确实是对每个峰都作了抑菌实验,Sephadex G15的每个峰都有抑菌活性.粗提物上G200只得到了一个吸收峰,要是我要的组分在后面,可它连个小峰都没有呀..此外,有人我,先使用硅胶柱对粗提物进行处理,请问可供选择的柱子有哪些?谢谢.
那你没有说明G200的峰是不是有活性,你也可以考虑硅胶填料,那得选择c8或者c4的反相硅胶的柱子,可以做HPLC,这样也是不错的选择,毕竟通常的凝胶柱子很难有很好的分离效果.
9)如果我用sephadex G-25脱盐,如何选择缓冲液?因为我认为,如果选择含盐的缓冲液,本身带入了盐,能起到脱盐的效果吗?如果选择含盐的缓冲液,
缓冲液选择看你需要什么缓冲液就选择什么,没有什么特别的要求.你的缓冲液当然是没有盐的,否则那何必除盐呢.含盐缓冲液当然不能去掉盐了,它只能把你样品中的盐去除,用的原理是蛋白在柱子中走得比盐要快,所以先出来.如果你缓冲液中有盐那虽然盐有后出的原理,但是因为你一直用含盐的缓冲液去冲柱子,所以它的盐是去不掉的,这和样品中的盐是不一样的.
筛其实也有载量的问题,但是关键还是看上样的体积,例如分离上样体积不能大于10%柱床体积,脱盐不能大于30%,具体的数和样品有很大关系. 10)既然这样,我想完全脱盐时,洗脱液可以选择水吗?因为缓冲液中的缓冲对总会有盐的存在,对不对?
11)请教色谱兄,我现在用纤维素分离纯化蛋白和peg-蛋白,跑完我用page检测了一下,没有完全分开,有一些是一起流出来的,我想知道为什么分离效果不好?我该如何调整阿?加长柱子可行吗?还是要更换介质阿?我用的梯度洗脱.多谢拉!
peg-蛋白要想完全分开是比较困难的,因为PEG修饰的程度不一样,所很难完全分开,不过纤维素分离的效果是要差点,你可以通过延长柱子,降低流速,延长梯度的办法来提高分辨率,不行你可以换琼脂糖系列的,但是我觉得你也可以考虑疏水,这两个方法都可以.此外洗脱你也可以用不同盐浓度阶段洗脱,这样有时候分离效果也不比梯度的差.
有的,到时候发给你吧.琼脂糖肯定比纤维素分离效果要好,载量也大,还有就是柱床体积不会变化,流速高.
13)想请较：质粒纯化中超螺旋和线性的如何实现有效分离(制备规模),且不使用plasmidselect之类亲和介质.
亲和是最有效的方法,我们有现成的工艺,包括去内毒素,你可以把你的邮件pM给我,我给你发一份相关的材料,你可以看看.
1.用的Ni-NTA进行亲和纯化,以前一直是在250mM咪唑中洗下目标带,现在50mM就有,是不是我的镍柱不太好使.
2.因为亲和纯化后我的蛋白在最,所以我现在用sephadex G-100,但是我发现效果很差,不仅回收率低,而且也只有小量的杂带能去掉.因为在我的目标带下面不久就有一个小的杂带,而且我想把我的蛋白去结晶,那样要求的纯度就很高.这样的话是不是选用的纯化材料不对,而且对于流速和柱子长度要求就很严格了.
我觉得你最好选择新的填料,其实你要是条件好的线%,我可以把我们的方法告诉你,你pM你的邮件给我就好了.
那实在不型可以考虑极性更低的乙酸乙酯等物质.此外洗不下来有没有可能变性沉淀在柱子上下不来,你的100%的ACN里面有三氟乙酸吗,我觉得出不来的原因有不少,不一定仅是洗脱的问题,所以用反相分离蛋白还是得很小心,此外不知道你的柱子是不是专门用于纯化蛋白的,因为孔径太小也不适合分离蛋白.
我觉得如果是沉淀也有可能,要不你就少上点样,或者降低上样的浓度,此外尽量洗脱要快点,用变性剂怕不是好的方法,因为浓度太高,很容易有变性剂析出,这样堵柱子或管道更麻烦,你可以开始就增加点ACN 的浓度,这样吸附力弱点,你也可以添加点极性小的溶剂,这样可以避免吸附力太强而洗脱困难.
这个可真的没有做过,不过一般的做法都是匀浆,然后用缓冲液提取,不知道你的是什么来源的样品,此外如果脂肪含量高可以先用冷的丙酮脱脂肪后再提取,我想细胞外基质中的蛋白也应该是用这些方法吧.
聚乙二醇是没有紫外吸收的,所以没有检测波长,即使有吸收,那也只在210nm附近有弱末端吸收,而很多物质在这个波长都会有吸收,所以检测它怕是不容易.
你用透析或超滤试试吧,还有个方法是用冷的丙酮沉淀蛋白,这样表面活性剂还是溶解的,这样也可以去除.
用冷的丙酮沉淀蛋白,那么丙酮容易去掉吗?如果试试superfine g-25脱盐的方法去掉triton,可行吗?
丙酮很好去,很容易挥发走了,你也可以用除盐柱子去除,但是如果它是和SDS一样能和蛋白结合,那用通常这些除盐,透析,超滤都没有办法去除,只能用沉淀的办法,而且是用酸性丙酮沉淀才能去除.
maleimide应该有紫外吸收的,你可以用紫外分光光度器去做全波长扫描,然后可以找到它的特征吸收峰,用这个波长做检测波长就可以,一般的HPLC带二极管列阵检测器也可以做全波长扫描,或者你选几个波长做HPLC也可以,只要没有干扰就可以了. 20)我现在想纯化一种蛋白,我的蛋白是14kD的碱性蛋白质,流程是这样的：原核细胞内蛋白表达,裂解细胞,SP-sepharose盐离子层析,HPLC Mono S过柱,去盐,HPLC C18过柱,最后得到纯化的蛋白.是一个成熟的protocol,我一直没有做过蛋白纯化,所以想向斑竹请教,HPLC上样量这么小,我有5ml的量,要多久才完成?
我觉得为什么要用两次强的阳离子交换柱子呢,直接过一步Source 15 S应该也可以,这样可以省去一步,而后再上HPLC,其实如果你的纯化如果做得好,不上HPLC也有可能,除非你们这个蛋白要求纯度很高,HPLC也有大的柱子,1X25CM的,一次上样可以0.5mL,十次也就完了,我觉得纯化还是尽可能不用HPLC的最好,否则成本高,而且不好放大.
21)你好,我的目的蛋白是GST融合蛋白,大小为42kD(包括GST),大肠杆菌表达,我想请教一下其纯化方法那很简单,破碎菌体,加pBS缓冲液稀释,上GST琼脂糖凝胶,然后洗平,用10mM还原谷胱甘肽洗脱,收集洗脱峰就可以得到你的蛋白.如果你的蛋白是包涵体,那需要复性再纯化就可以了,我给你发一份我们的材料供你参考.
国产也有相应的填料的,你pM你的邮件给我,我给你发一份国产的目录,不知道你需要多少量呢.疏水其实和亲和一样,只要配基团密度一样,载量就差不多,还有就是刚性好就可以了,填料的合成也不是很神秘的,更不是不可逾越的.
23)我的课题涉及多次不同蛋白质的纯化,我现有国外的一个protocol可以参考,但国内实验室的条件有限,担心如果任意更改纯化方法,结果不理想时又不好分析原因.十分地苦恼,想听听您的,不胜感激!
我纯化的第一个蛋白质,是由稀释复性而得的三个亚基组成的复合物,这里纯化的目的主要是脱盐更换缓冲液和浓缩(为了下一步的酶催化过程).我己经用冷冻抽干法将200ml的体系浓缩为10ml,下一步准备用透析脱盐及超滤浓缩,但对于超滤离心管的选择还无头绪(条件有限不可能添置大型超滤设备),上网查也不得要领,如果您有相关资料,能不能发到我的邮箱. 关于浓缩的方法,冷冻抽干法、PEG、蔗糖、硫酸胺沉淀法各有何优劣?冷冻抽干法和硫酸胺沉淀不会蛋白的活性?蔗糖会不会影响后续的超滤?
我纯化的第二个蛋白质,是经过酶催化的该复合物(110KD),这里纯化的目的主要是去除体系中未组成复合物的单个亚基(36KD、13KD、1KD)及36KD亚基的aggregate,国外的protocol推荐用凝胶层析,但我询问做过的人说分离的效果并不理想(原因不清),我是应该优化凝胶层析的步骤还是应该选用其它的层析方法?没有蠕动泵和收集器(只有层析柱和低温冰箱)能不能做凝胶层析?如果能做如何尽量提高其分离效果?选择层析柱和填料有哪些原则和注意事项?
Native-PAGE时,样品的盐离子浓度和样品内的其它蛋白质会不会影响电泳结果呈阴性?Native-PAGE和一般SDS-PAGE不同之处是否仅仅在于：凝胶和电泳、上样缓冲液中不加SDS;样品中不加DTT或β-巯基乙醇,不经100℃煮沸处理;电泳时保持较低的温度(4℃)?
问题多多,实在是因为本人是初次涉及蛋白质纯化领域的门外汉,除了您推荐过的书,您还能不能推荐一些专门的网站、公司的操作手册(您如果有买了产品才能获得的,能否也EMAIL惠赠?)谢谢!!!
1.10ml的样品除盐浓缩用透析就可以,这样体积不会变大,同时透析除盐完加PEG8000粉末在透析袋外面就可以浓缩,很方便,超滤包括离心管都不便宜,而且样品不多怕损失多,所以我觉得还是用简单的方法好.
至于浓缩,有条件那用冷冻干燥,超滤都是不错的,硫酸铵沉淀不能当作浓缩的手段,因为它需要蛋白到一定的浓度,而且浓缩后的样品要除盐,回收率也不高,透析袋+PEG浓缩我觉得也是不错的方法,特别适合没有超滤和冷冻干燥的实验室,而且成本低,适合小量不适合大量,蔗糖浓缩我们用过,应该不好用.冷冻干燥和硫酸铵沉淀一般蛋白都不会失活的.蔗糖一般不影响超滤,只是粘度增加,这样超滤会慢的.
2.既然文献是用凝胶过滤,你也用完全没有问题,我觉得分离这些量差别比较大的,那凝胶过滤是不错的选择,只要选择好合适的填料,装好柱子就可以,层析的基本条件还是要的,包括泵,检测器,记录仪,要不很难知道收集也不方便操作.填料的选择主要看你的目标蛋白和杂质量的差别,例如你的110KD和那些36KD以下的,那你可以这样选择sephadex G 75,你的这些36KD以下都在它3000-80000之内,而你的110KD在外水体积直接就出来,后面的都是小的,当然也可以选择Superdex 75,它的分离范围在70000-3000,只是它们价格不同,后面的填料刚性更好流速快,前面的便宜,流速慢些,这些就看你的经费了.
3.电泳别的蛋白不应该影响,但是盐是有影响的,所以样品要除盐,可以用凝胶过滤,透析,超滤除盐.保持底温也许是为了保持蛋白的活性,做小量制备.
这个网站有不少相关的材料,相信很有帮助,此外我可以把我们全部的材料发给你,希望对你有所帮助.
24)如果分离50KD,36KD,13KD这三种蛋白质,最好选用那种凝胶层析用填料?如何确定需用的层析柱的直径和高度?
选择sephadex G75或者superdex 75,柱子的大小一般都是按你的处理量算的,通常的柱子大多是1.6x60,2.6x60,或者有100cm的柱子,内径为1.6或者2.6的.也也有更粗的.一般都不会有问题.
2没有泵那我觉得凝胶过滤很难收集样品,除非你用自动分部收集器按一定的体积去收集,然后用紫外分光光度器去扫描测定浓度,这样再根据每管的蛋白浓度做个色谱图,按峰型把各管合并,上样注意要沿柱子的四周缓慢加,最好先把下面出口封闭,让液体不流动,上完样品后再打开下口,这样可以上样比较均匀,当胶平面没有液体的时候再用你的平衡液体按上样的方法加就可以,然后再打开下口,千万别让液体流干,也不能把胶平面冲坏.收集的时候可以按5m或者10ml一管,时间是根据你柱子的流速.
SP免疫组化法,全称链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶连接法.你购买的哪家试剂盒都有很详细的方法,或者你上一些提供试剂盒的公司网站联系他们都可以得到详细的材料.
我有一个问题想请教,在以前的贴子中没有看到.我要做抗体的真核表达,为分泌表达,表达出来的蛋白没有标签,因为希望尽可能保持抗体的结构,因此不能用那些针对组氨酸等标签的的柱子,我的抗体是个融合蛋白,大约是IgG的三分之二大小,是sCFv和CH3连接而成二硫键连接的双链,没有CH2区,我看proteinA和proteinG柱子都是要结合FC,那我的蛋白FC不完全的话还能用吗?要不我怎么办啊?还有,对于没有标签的抗体是不是无法和细胞培养使用的小牛血清中存在的抗体样物质分开呀?是不是必须要无血请培养.我简直不知道该怎么设计实验啦.谢谢.
你好,我看的书上说CH3是FC受体的结合区,而C H2是补体结合区,这说明蛋白A和蛋白G应该是和CH3结合的,你可以表达出来用蛋白A或G的试试,此外抗体有很好的疏水性,用疏水色谱也可以用于纯化抗体以及抗体的一些片段,包括单链抗体,至于血清中的抗体,它们和亲和柱子以及疏水等的微小差别通过改变洗脱条件得到纯化,当然你可以用无抗体的血清培养或无血清培养,我觉得你还是选表达出来再说了,而血清中的白蛋白很容易用染料亲和的方法就可以去除.
27) chromatography,您好!我现在用的Ni-NTA进行亲和纯化一个约45KD的蛋白,关于菌体的破碎,有人推荐用溶菌酶,有人说超声波,我用溶菌酶试过一次,但12000*20min离心后,上清中没有目的蛋白,你能不能将相关的材料也发给我一份
用超声破碎的比较多,如果你有设备的话这样破碎比较好,因为时间短,破碎效果也好,而溶菌酶不完全,而且不大好操作,我不怎么做上游,不很清楚,你可以再仔细问问别人有关破碎的问题,纯化的材料我给你发一份,希望对你有所帮助.
一般添加的都是小的物质,而且也不会和目标蛋白结合,纯化过程一般就去除了,所以不用特别考虑去除的问题.
2,您所说的处理量指的是样品的质量(mg)还是上样的体积(ml)?就我所知有两种计算方法.其一是根据质量算：蛋白质技术手册(汪家政)上说有一种工式：柱直径=(m/10cm)1/3其中m是蛋白的质量(mg),柱的长度=柱直径*30,但这个柱直径的计算公式我没看明白,用不上;其二是根据上样体积算：如果上样量是1ml,按1%的柱床体积则需要100ml树脂,直径1.5-1.6,长度50-60,但如果按2-3%的柱床体积则只需要30-50ml树脂,这样柱参数的变化又极大.您通常是怎样计算的?(具体到我所要分离的蛋白上样量是1ml,包含杂蛋白的总质量是4mg)
1.G100刚性不好,容易因为压力,盐变化而体积改变,实在没有办法也只能用这个,但是你要保持恒定的流速,,盐或缓冲液的浓度,这样才能有很好的分离效果,说明书我想不好找,但是它和所有的sephadex处理是一样的.
2,处理量对于凝胶过滤一般是按体积算,通常上样量是柱床体积的5%左右应该,如果很接近,也可以降低到2%,你的1ml样,1.6x60cm的足够了.
地址：陕西省西安市灞桥区新寺569号唐都医院临床教学楼312室 邮箱：zhyxwz@126.com 联系电话 传线号 技术支持：陕西奈特星网络发展有限公司
最新评论