对于Western Blotting实验而言,样品处理是关键步骤之一,获得的蛋白样品必须均质、可溶,并解离成单个多肽亚基,且尽量减少相互间的聚集,使其最终仅依赖本身的量大小进行分离.当目标蛋白的含量很低时,需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物）,或者通过免疫沉淀等方式进行富集.通常样品有重组蛋白、细胞和组织等.
贴壁和悬浮细胞收集方式不同,细胞裂解液种类各异,推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解,煮沸即可.
样品电泳前需测定蛋白浓度,以便上样量一致,有利于后续定量或半定量分析.常用的蛋白质浓度测定方法有好多种,其灵敏度和所需时间不同,且不同的方受不同干扰物质的影响,实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择.
b. 样品浓度应适中,1×SDS凝胶加样缓冲液用量：贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml,悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入；
c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要,浓度应控制在2-10%之间,并根据具体需要调整；
电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳,Western Blotting中常用的是不连续缓冲系统下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,该法中由于变性的多肽与SDS结合而带负电荷,在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的量相关.凝胶的筛分特性取决于它的孔径,而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数.
c. 各泳道上样体积最好大体一致且适中,体积偏差过大会相互挤压导致条带走形,为避免边缘效应,可在未加样的泳道加入等量的样品缓冲液；
e. 如有特殊需要,可以使用梯度胶,高浓度丙烯酰胺可以使低量蛋白质形成清晰的条带,还能在一块胶内同时分离量范围更大的蛋白质.
蛋白质经SDS-PAGE分离后,必须及时从凝胶中转移到固相支持物上,固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性,而且支持物本身还有免疫反应惰性,这使其比直接在凝胶上检测更易操作,试剂用量更少,更省时,效果更好.
蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法,分为半干式和湿式转印两种模式,与SDS结合的蛋白由于带有负电,在电场中向正极迁移,并最终结合在固相支持物上.两种方法均卓有成效,且各有所长,实验者可根据实验情况不同进行选择.
a. 样品属性、膜类型、胶浓度以及转移缓冲液均会影响蛋白质的转移效率,比如小量蛋白与大量蛋白相比,迁移迅速,但结合不牢固；
b. 蛋白与固相支持物结合的程度受多种因素影响,如膜属性（孔径和类型）,缓冲液属性（pH值、盐离子种类、盐浓度、去垢剂等）,如实验结果不佳,可分别进行优化；
c. 如果转膜与电泳的缓冲液系统不同,转膜前应将凝胶在转膜缓冲液中平衡,防止凝胶膨胀或收缩,以条带清晰完整；
d. 提高蛋白质转移效率的方法：转移缓冲液中加入甲醇或低浓度的SDS （0.02-0.1%）,使用小孔径膜,转移后立即用戊二醛交联；
f. 转移效果可通过染胶（考马斯亮蓝染色或银染）或染膜（丽春红S染色、印度墨汁染色）来鉴定.
在进行抗体杂交之前,需要采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭,防止免疫试剂的非性吸附,从而降低背景,增加灵敏度,提高信噪比.常用封闭物有脱脂奶粉和BSA（稀释于不同的缓冲液中）,但不同的抗原-抗体反应,封闭条件均不相同,没有适合所有系统的封闭液,具体封闭条件（包括封闭液浓度、缓冲液种类、封闭时间、温度等）需自行优化.
a. 影响非性结合的因素很多,针对不同的免疫原,其封闭条件均可进行优化,没有通用的封闭液,因为每个抗原-抗体反应都具有独特的性质；
b. 在选择封闭物时,最重要的标准是信噪比,封闭条件不足,会导致过多的背景噪音,封闭条件过度,会造成信号变弱；
c. 可根据不同的检测系统（碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）、蛋白质属性（量大小）选择适当的封闭物及缓冲液（PBS或TBS）.
封闭后,目标蛋白便与性的一抗进行免疫反应,一抗可以是标记的,也可以标记的.标记的一抗与免疫原结合后,可直接进行检测（直接法）,降低了背景和非性结合,但信号较弱.非标记的一抗配合标记的二抗使用（间接法）,对信号有级联放大作用,可以增加灵敏性和信噪比.二抗既可标记放射性同位素,也可标记染料或其他,或与酶偶联.常用的酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP）,通过与底物反应产生光信号.
a. 标记方法的选择视灵敏度和易操作性而定,通常有四种标记系统：化学发光、放射性同位素、荧光、化学荧光；
c.单抗和多抗各有利弊,多抗便宜、制作省时、亲和力高,但性不佳；单抗性好、纯度高、重复性好,但制作工期长,价格较高；
d. 一抗稀释比例及反应条件（温度、时间）视抗体效价而定,并需根据实验结果进行优化,二抗一般可固定一个反应条件（1:4000、室温1小时）；
e. 清洗步骤对移除未结合试剂、降低背景、增加信噪比至关重要,清洗不够会造成较高背景,清洗过度会导致灵敏度降低,清洗液的成分可适当调整.
根据二抗的标记物不同,其显色方法也不同,并通过或影像系统（CCD）收集.较常用的检测系统有HRP标记二抗的增强化学发光（ECL）和DAB检测系统.
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