看你蛋白情况了,一般也就2M左右吧.挂不住就提高浓度,挂太牢就适当降低盐浓度,一般要根据实验决定.我一般就用苯基琼脂糖凝胶,一般纯化IgG用0.7M硫酸铵就可以挂住.
你有个贴子中说在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同至少相当.我想试试你说的硫酸铵沉淀后直接过疏水柱,那我是不是要先确定复溶后样品的盐浓度再确定平衡缓冲液的盐浓度啊,如果是我怎么检测样品的盐浓度啊
其实差不多就可以,也不一定特别严格,例如疏水盐浓度你的样品的盐高于平衡的也可以,但是别相差太多,尤其不能样品的盐浓度小于平衡缓冲液,这样也许挂不住,或者会产生沉淀.而缓冲液和盐浓度不同混合也许会产生沉淀,所以要小心,而一样的缓冲液体系和盐浓度可以避免这样的问题.
硫酸铵沉淀后的样品,如果是上清按盐浓度稀释到你缓冲液盐浓度就可以,如果是沉淀,直接用缓冲液去溶解,沉淀里的盐可以忽略.
2)我在用镍柱亲和纯化后,蛋白已经比较纯了,仅在银染时能看见微弱的杂带(目的蛋白约25KD,杂蛋白约40KD).但我还想试试能不能完全去除杂带.此前试过筛没效果,所以想试试离子交换.想请教一下,在变性条件下可以做离子交换吗?和复性后再做比起来哪个效果好呢?非常感谢!!
浓度太低一些杂带是很难出现的,所以这样的纯度很难说,我觉得得浓度高到25mg/ml左右,这样做电泳才能看得清楚些到底纯不纯.如果你是变性条件下做凝胶过滤没有意义,因为这时候蛋白是链状或者是不蜷曲的,不是球型,所以在这样的柱子中没有办法使他们分离,你最好的方法是优化你的亲和纯化条件,也可以在纯化前做好预处理,如果是包涵体,可以用分级沉淀的方法来初纯,亲和柱子的缓冲液中加点土温或者用pH洗脱和咪唑洗脱的方法配合,同时用阶段洗脱的方法,一般都能做得很好,用试剂盒的方法或者线性洗脱的方法有时候很难得到好的效果,你也许可以参考我们的方法,你留下邮箱我给你发一份做参考吧.
我觉得离子交换也不一定好,在脲这样的变性剂下可以做离子交换,但是效果也不一定好,我觉得还是优化亲和条件更有意义.此外浓度太低很难纯化.
如用环氧活化的琼脂糖凝胶纯化血清IgG,先要偶联其相应配基如抗体或蛋白A是吗?这里琼脂糖凝胶用环氧活化的意义是什么?
几十毫升如果一次纯化也就用几十毫升的重组蛋白A琼脂糖凝胶FF就可以,也可以分两三次纯化,这都没有问题,如果是你想做血清中的抗体纯化也可以把抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶上, 这样得到的抗体更纯, 一般不选择蛋白A, 环氧活化便宜,而且相成的键很稳定,没有非吸附,是个不错的方法.
分级沉淀包涵体其实很简单,用6M盐酸胍溶解包涵体,然后用缓冲液稀释到5M,然后混匀离心,上清继续稀释到4M,如此类推,一直到1M,这样把每次的沉淀和上清跑电泳,就可以知道在哪个浓度下包涵体中目标蛋白是最纯,而且收率是最高的,这样得到的包涵体蛋白比普通的洗涕方法要干净而且,再纯化就好多了
加吐温很简单只要在平衡和洗脱的缓冲液中加0.5%吐温可以降低非吸附,使洗脱的蛋白更纯,其他的操作和一般没有什么差别,材料我已经发了,请查收.
一般柱效是常用1%的柱床体积的丙酮过柱子,柱效=柱高/理论塔板数,而每米理论塔板数=5.54/(Ve/W1/2)2,其中Ve是保留体积,W1/2=半峰宽,一般很少测定这个值.
因为上样环最小100微升,所以就上了100微升的丙酮,然后用蒸馏水冲洗,没有峰出来,后来我用2毫升的NACL冲洗了5个柱体积,还是没有峰出来,然后我想里面可能没有物质了,就用蒸馏水想冲平,结果出现了3个峰
1ml的预装柱根本不需要测定柱效的,如果不是凝胶过滤也许需要,如果是亲和和疏水等没有这个必要,你不出峰我觉得是检测波长不对,因为丙酮在280估计吸收非常弱,你得换个波长,洗脱水就可以.后面出的应该是杂质.6)chromatography兄：您好!因为我对色谱一窍不通,所以有一些基本的问题想请教于您.我现在正准备用HPLC分离提纯一种细菌的外毒素,它是一种碱性丝氨酸蛋白,量大约是33KDa,按照文献的方法,是先用硫酸铵分级沉淀后再上疏水柱(HIC, phenyl sepharose high performance, Pharmacia),然后再用凝胶过滤柱((with Superose 6 HR10/30, Pharmacia),我查了一下,这两种柱子好像都是预装柱.我想问你的是,什么情况需要发放大?是多大的量?我只是想分离出来做单抗和测序以及做免疫性,那么需不需要放大?
另外：这样的两根预装柱加起来差不多要花4000美元,代价太昂贵了,那么有没有便宜的柱子且纯化效果也不错的?
最后一个问题：如果我想让公司代为纯化,您觉得可行吗?如果可行,请问你知不知道哪里有这样的公司?
你好,其实你这个纯化不一定需要专门的预装柱,当然你要用也可以,我们公司就有苯基琼脂糖凝胶柱子和填料,你要做多大都可以,至于凝胶过滤Superose 6是比较贵的,何况是预装柱,你可以用sephadex G-50应该也可以,这样组合会比较便宜,公司做纯化一般是比较贵的,你做多少量呢,一般钱给少了公司觉得不合适,多了,你觉得贵,纯化这样的蛋白估计也上万元,而且看你难度不同收费也不一样,我觉得你还得自己做.你做的量估计不需要多大,100mg足够用了吧.这样不需要多大的柱子就可以.
不很明白,电泳不能检测吗,也可以用HPLC的凝胶柱子去检测,纯化和成盐关系不大,只要调pH应该就成游离的蛋白了.不知道你的杂质都有哪些,很难说用什么方法.
8)我的蛋白等电点预测是6.5,应该选阴离子柱,但是目的蛋白和一些杂蛋白都穿过.但用阳离子CM柱后却能挂柱,经洗脱后纯度很好.请问这该如何解释?
这个很正常,你的这个蛋白用阴柱或者阳柱都可以,因为它的等电点在中性,所以都可以用,至于穿过也许pH不够高,或者吸附力弱,再不就是预测有偏差.
9)在做HPLC之前要求将样品过滤,但是我的样品过滤以后就没有活性了,有可能样品与超滤膜结合了(但活性丢失的真正原因我不能确定).现在想问色谱兄,怎样进行该蛋白质的进一步纯化!
样品过滤不该用超滤的膜,用普通的0.22um的膜就可以了,没有活性那蛋白也没有了吧,我怀疑是超滤膜把蛋白截留了,这样样品当然没有活性了
10)色谱兄你好!我买了WHATMAN的纤维素DE52阴离子层析柱,我想问一下,上样洗脱后,层析柱最后应洗脱到什么程度,是不是要基线跑平了才行?这样后下次使用,用不用再生?怎样再生,用碱还是用酸?多大浓度?DE52使用的pH范围是2-9.5.怎样贮存好?
应该洗到基线个柱床体积,再用水洗,保存可以保存在20%的乙醇中也可以,其实你应该按照说明书的去做,我好久没有用过这个填料了.其实用DEAE琼脂糖凝胶不是更好吗,这个填料有点老.
11)我准备用Gravity-flow柱纯化蛋白,但没有的UV检测仪和收集器.能否在FPLC系统上直接运行,而不用启动泵?如可以要如何设置?或者有没有其他方法?
不知道你用的是AKTA prime还是AKTA explorer, 有不少型号的,我觉得不好接,因为这些系统的管道很难靠重力可以流动液体,如果是AKTA prime也许好改点,你可以问他们的工程师吧
12)谢谢chromatography,因为醋酸量很小,用电泳或凝胶柱效果可能不好,现在主要是如何检测纯化后样品中的醋酸残留,因为没有对照品,测蛋白含量就不行了.能不能用醋酸对照,用离子色谱测醋酸含量呢?没做过离子色谱,不知道用什么检测器合适,请chromatography朋友指点.
你说的是检测醋酸呀,我以为你是要把醋酸和蛋白分开呢,如果是检测,如果是这样,你可以把你的样品加点盐酸,这样变成酸性那你的醋酸应该可以游离出来,毕竟蛋白会和盐酸成盐,或者用硫酸也可以,然后你用气相色谱的氢焰检测器就可以检测,而且很灵敏,这样应该就好了
如果是这些酸我可不知道怎么检测了, 这得看无机化学怎么分析这些酸了. 其实你的蛋白在碱性条件下就不会成盐了,没有这么复杂吧.
13)请教chromatography：最近我想做关于蛋白纯化方面的实验,因为是新手,所以想请教几个问题,谢谢!
我的蛋白是70～80KD左右的,HIS标签,怎样确定是以可溶形式还是包涵体形式表达呢?若是包涵体是先让其溶解、复性再进行纯化,还是先纯化再进行溶解复性呢?我想用Ni+琼脂糖凝胶进行亲和纯化,应选用什么型号的填料呢?实验过程应注意些什么呢?
破碎你的菌后, 有上清也有沉淀, 分别跑电泳, 如果上清有目标蛋白, 沉淀没有那说明是可溶的, 如果沉淀也有, 说明两个都有, 但是看哪个更浓, 如果沉淀更多, 那应该是包涵体.
据说蛋白越纯越好复性, 所以我觉得应该先纯化再复性, 至于填料我们一直用我们公司的产品, 和进口没有什么差别, 我把我们的材料发给你一份, 里面很全面, 希望有所帮助.
14)我今天本打算试试你所说的分级沉淀法初纯包涵体,但仔细想想还是有点疑问,需要再请教你一下.
1、具体的操作步骤是不是应该用含8M尿素的buffer来超声破碎菌液沉淀,然后把上清用不含尿素的buffer来稀释呢?
2、稀释时是将上清分为几份分别稀释后离心,还是要先稀释到7M,离心,再把上清稀释为6M,依此类推呢?
3、比如说我稀释到3M时沉淀里的目的蛋白最纯,那我下面是应该选择含3M尿素的buffer洗涤包涵体,再用含8M尿素的buffer溶解沉淀;还是应该直接用含3M尿素的buffer溶解包涵体,离心后取上清用于下一步的纯化呢?
不好意思,再问一下,那我是不是应该先用一小部分包涵体试一下,如果发现3M最纯就直接稀释到3M. 还是摸好条件后还要分级沉淀至3M呢?
15)Hitrap的脱盐柱如何使用?我的样品是否需要浓缩后到1.5ml的体积再上脱盐柱,然后接样品即为脱盐后的样品.
我不知道你的除盐柱是多大的柱子,一般除盐可以做到20-30%的柱床体积,你根据你的柱子可以算出你能除盐的体积,你的预装柱都有说明书教怎么用,很简单,用平衡缓冲液冲柱子3个床体积,然后上样,再用缓冲液冲,收集蛋白峰得到的就是不含盐的样品.
16)1.我用酵母表达系统做肠三叶因子表达,如果用融合蛋白(c-myc)有利于纯化,但不知如何去除融合蛋白?2.如果不用融合蛋白,又不知如何纯化?
据说这样的融合蛋白不需要酶切,改变温度或pH就可以自动切去,除去还用原来的亲和柱就可以,你也许可以带his标签,这样不大影响你的蛋白的结构和活性,如果不是融合蛋白,那得看你蛋白特性,用疏水,离子交换等常规方法去纯化.
17)请问chromatography老师,蛋白质糖基化修饰后其纯化时的条件与修饰前会有什么样的改变?我用毕赤酵母表达的蛋白可能被糖基化了,而组织中该蛋白糖基化的,用组织中的提取条件怎么也不能将我表达的蛋白提纯,应怎么考虑,怎么办?
19)我纯化的原核蛋白以可溶形式存在,但活性没有(含三对二硫键).我看到一篇文章,发现蛋白经还原和烷基化处理后,活性出现.不知那位高手告知原因为何以及还原和烷基化的方法?
我怀疑是二硫键错配,所以没有活性,当还原后再烷基化,这样不会再形成二硫键,也许这样导致蛋白有活性,还原的方法很简单, 加巯基乙醇或者DTT, 搅拌, 就可以还原, 烷基化,应该是巯基的修饰剂,常用的有DTNB,PDS,PMB(参考<酶工程>中的酶修饰章节)
20)关于蛋白质分离提纯方面,蛋白质的测定除了凯式定氮外,还有那些比较新而且权威的方法,(BCA法过时了吗)?分离纯化时疏水层析,凝胶过滤,离子交换等方法梯度洗脱时,洗脱液浓度是怎样变化的?
洗脱离子交换盐浓度由低到高,可以用梯度混合仪或者机器自己带的混合系统实现,当然也可以用阶段洗脱的方法,这样不需要专门设备,重现性好,很容易放大.
疏水和离子交换刚好相反,开始是高盐,洗脱是逐渐降低盐浓度,洗脱方式也可以用线)我发酵液中的目的蛋白含量少,所以想在等电点进行硫酸铵沉淀,请教仁兄：是不是用酸碱把我的发酵液PH调到目的蛋白等电点,再进行硫酸铵沉淀就可以了?能用强酸强碱吗,有什么注意事项吗?
如果你的目标蛋白含量太低不大适合用硫酸铵沉淀,当然你要调到等电点附近去沉淀也许能行,得试试才知道,不知道这样蛋白是不是有活性,你只有试试才知道,你电泳要不浓缩看不见目标蛋白的话,用这样的方法怕很难有好的结果.你也可以把pH调到等电点用冷的丙酮沉淀试试.最好用弱酸,醋酸等非用强酸也要用浓度低的溶液.注意事项应该在搅拌情况下缓慢滴加,避免局部浓度过高,此外沉淀对蛋白浓度是有要求的,太低不适合.
表达的蛋白如果有亲和标签的话,不需要浓缩可以直接上柱,柱子本身就可以浓缩富集你的目标蛋白,如果没有标签,用离子交换或者疏水都可以浓缩你的样品而且可以初步纯化.
22)我想请教一下,我现在提取植物中的一种酶,含量可能很低(GUS酶),我直接用提取液来提取,然后经过80%硫酸铵纯化,结果感觉特别粘稠.
另外,跑聚丙烯酰胺凝胶电泳时发现跑的极其难看,很歪,而且是一开始浓缩胶的时候就跑的歪歪扭扭的.(看溴酚蓝)
我是第一次做蛋白相关的东西,请指教!(GUS酶)是这个β-葡糖醛酸苷酶吗, 我怀疑没有提取好或者浓度太低所以电泳没有跑出来, 至于电泳开始就歪, 怀疑是你的样品溶解不好, 有沉淀或者盐干扰, 电泳最好先除盐, 此外浓度太低不能用硫酸铵沉淀, 我怀疑也许浓度低, 你要的也许还在沉淀上清里.多糖按理过离子交换柱子, 植物中的样品做得不多, 你多看看文献吧.
23)你好,我现在用的QAE A-25出现死吸附,不能再生,看看有什么好的方法,我用过的再生方法是2N 的NaOH,0.3N的酸、碱,还洗不下来就又用了0.5N的丙酮溶液(50%),还是不行,请教一下您还有什么高招吗?
那就用盐酸胍或者脲洗看看,也许变性沉淀了, 用通常的方法也许洗不下来. 也可以加点蛋白酶试试.
24)量700的化合物应该选择G-10 或G-15 ,如果是离子型的或用离子型交换剂可以除去杂质的话就用QAE 或DEAE, 不过工业生产用G,因为QAE或DEAE体积受酸碱及离子强度变化太大.
小物质最好别用凝胶过滤去分离,估计没有什么效果,除非是和很大的分离还可以,带电荷那就选离子交换,也可以选择反相
25)您好,我有一个非常头疼的问题请教：现在在装一根XK1.6cmx100cm长的superdex prep grad 75柱,系统使用的是AKTApurify100,用装柱器一次性装入胶体,柱效测得8850N/m,低于10000N/m的要求,但是由于流速1ml/min时压力逐渐升高我将在线滤器卸下,压力降低后再测柱效为何变成了5500N/m?还想问问您装柱头时是否不能压得过紧?技术支持说这样会导致峰前倾,我在最大流速3ml/min冲了1小时后将柱头压下6mm,测得的对称因子是1.75,低于0.3-1.3的要求,请问是否是因为我压胶过紧?
还想问问您装这种极细长的凝胶柱除了将胶一次性倒入外到底还有哪些因素影响柱效?问了技术支持说没别的就得一遍遍装,逮到哪次算哪次,真是这样吗?柱子太大流速太慢,从装好到测完柱效要2、3天,所以急盼您的指点,非常感谢!
我觉得测定柱效是其中的一个方面,最重要的是跑个样品试试看,我觉得你装柱子的一个问题是在一次倒入填料后应该用最大流速去过柱子,等压力平稳后,你把柱子的转换头接上压紧,这样再用低于你最大流速的来操作,压力不会升高,柱床也不会变化,其实对于压紧的柱子也不一定需要重装, 你可以反冲, 这样压力一般就会平稳, 别太柱效测定, 因为还是有误差的,如果装完的柱子柱子前后效率差这么多,那这个填料就不好用,但是填料本身应该没有问题,所以说不应该太相信这个东西, 我一般装完柱子根本不测柱效, 一样用,此外我觉得纯化也别过分依赖凝胶过滤, 装柱子时间长, 而费时间也长, 上样量也少, 其实成本很高,效率却不一定高. 能用别的方法就别用这个方法.
应该没有问题,蛋白不会沉淀或者过不了柱子的,它可以从填料的缝隙中过去,别担心,一样能用,如果不放心,那也可以用G50,你先试试就知道了.
27)我正在做蛋白活性的分析,需用空载体PET28B-HIS 蛋白作为空对照,但是它太小了怎样才能得到呢?
抱歉,我不是做上游的,我觉得你可以随便找一个带his标签蛋白,它肯定没有你目标蛋白的活性,这样做对照就可以了.
28)现有一个困扰我多时的问题向您请教.我们的蛋白以包涵体形式在i中表达,利用SP-sepharose FF纯化时,在梯度10%-100%都有目的蛋白被洗脱.请问您是否遇到过这种情况,据您考虑这是什么原因.非常感谢.
这个我没有做过,我觉得变性条件下蛋白特性和普通不一样也许造成这样的结果,你可以参考包涵体清洗,那样就可以得到比较纯的蛋白,我觉得在变性条件下,非亲和的方法很难做好纯化.
29)神经细胞膜N-甲基-D-天冬氨酸受体蛋白纯化的技术线及关键点的指导,有功能活性,量少就可以,105KD的复合蛋白,用抗体结合柱子是否需要抗体量很大?洗耳!
抗体肯定需要很多的,一般每ml偶联抗体应该在10-20mg,那需要20-30mg抗体,抗体也不便宜,你这样不如直接把N-甲基-D-天冬氨酸或者天冬氨酸偶联到填料上做成亲和填料,然后用这两物质竞争洗脱也许更好一点.你可以试试,如果天冬氨酸可以那就更简单,我们公司可以帮你合成,或者提供活化好的介质自己偶联.30)我现在用glutathione sepharose 4B纯化原核表达的GST融合蛋白(可溶性的),目的蛋白大小47KD,pI=9.9, 但是纯化后在融合蛋白(73KD)下面60KD左右处有一条含量较多的带,并且在50KD左右,40KD左右,26KD处都有很清晰的带,我裂解细菌时加了PMSF,纯化过程是照说明做的,PBS洗的次数超过说明书的用量,还有一次加了1%的Tritonx-100,用还原型谷胱甘肽洗脱的pH=8.0 ,总共做了三次,但每次结果都一样,目的蛋白只占1/8左右,我的要求也不是很高,最起码也要60%就可了,但为什么那么多杂带呢?很郁闷,请搂主帮帮我,谢谢!
怀疑是降解或者表达后自己降解或者破碎时候条件剧烈而断裂,所以有好几条带,你可以用GST抗体做WB试试,你也而已用不同浓度原型谷胱甘肽洗脱看能不能得到更好的结果.
您说的降解的问题我也考虑过,但是我超声的时候加了PMSF,是不是还需要加别的东西,表达后降解如何避免呢?我用GST 以及目的蛋白做了WB,但我的这两个抗体都是多抗,做出来都有带,性不是很好.您说的不同浓度原型谷胱甘肽洗脱,我可以试试.您还有什么,请不吝赐教,非常感谢.
别客气,超声如果时间过长或者强度比较大,那也可以使蛋白断裂,杂带增加,所以你可以试试缩短点时间,这种断裂加PMF也没有用.此外由于GST纯化用的填料本身也是有离子交换作用的,因此在缓冲液中适当加0.5M NaCl可以降低非吸附,使杂带减少.
我还有一点不明白,您说的(缓冲液中适当加0.5M NaCl),其中缓冲也是指用来平衡柱子的缓冲液吗?还是指超声时的缓冲液?还是洗脱时的缓冲液,对不起,我没有很好的理解您的意思.再次让您费心了.谢谢!
那也许本身你表达出来已经降解或者象他们说的非完全表达,那这样是上游的问题,所以最好是能确定问题出在哪里.实在不行没有办法从上游解决,亲和一步也解决不了.你只好用离子交换,凝胶过滤或者疏水做进一步纯化.
31)我的物质也是个小,量800左右的一个修饰过的肽.用凝胶过滤除不去带色杂质,用QAE 或DEAE就去除的很好,可是带色的杂质在柱子上就洗不下来了.
32)请问亲和层析样品上柱之后目的蛋白洗脱不下来怎么办?我按照文献的方法,用pH4.0,1M NaCL的醋酸缓冲液洗脱,杂蛋白可以洗下来,但是目的酶跑电泳检测和酶活检测都没有,并且平衡缓冲液冲出的杂蛋白也没有目的酶.所以我怀疑是吸附在柱子上没洗掉,又用含10%DMSO的洗脱液洗,还是没有.请帮忙指点一下该怎么办?
用更高浓度的盐,更低pH试试,此外也可以用一点变性剂如1-2M脲试试,加DMSO要小心变性蛋白沉淀
1.进样峰大是什么原因呢?尽管进样前已用约10-15倍柱体积的5%bufferA(0.1%TFA)去平衡柱子了.
2.用vydac c4的柱子纯化lysozyme标准品(SIGMA),上样量为100ug时总有多个峰,改为30ug时就只剩下一个峰;但将浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰.这是为什么呢?
我没有做过几次HPLC分析蛋白,进样峰大也许还是样品本身的问题,你可以直接用缓冲液或者水试试,看看是不是也这样.
后面的问题我不明白浓度梯度放缓,上样量为100ug时也只有一个峰是什么意思,是洗脱梯度吧,我想如果是这样,那也许是上样浓度过高,而你的洗脱有机溶剂浓度高溶解不好吧,仅供参考
34)请教chromatography大哥, 我欲纯化精浆蛋白(前列腺抗原),前面的同仁最初试过从中提取纯化,但据说跑出来的带量不对,请问这是怎麽回事?谢谢!
我不知道在哪里看过这个蛋白的纯化,好象是用亲和的方法,量不对差多少,仅靠量是不行的,最好有活性测定的方法. 35)请教chromatography兄,我欲纯化一个量16K的蛋白,pI5.5-6.0,为什么很多文献中提到的纯化方法是用阳离子柱,缓冲液pH7.0,那样的话,蛋白不就带负电荷了吗?还有,我用酵母表达该蛋白,试用Q柱纯化时,色素大部分结合到柱上,不知道该怎么办?
用阳柱是不是主要去杂质的,色素不和你蛋白下来没有关系,最后可以用00.5MNaOH+2MNaCl洗看能不能洗掉.
36)还有个问题就是我做的工作是将鼠抗体人源化,肯定要用到大量抗原来筛库,前面人纯化的精浆蛋白是不够的,有人告诉我将剩下的精浆蛋白在原核中表达,会比从前列腺组织块中提取快,而且量也多,但有人说这样复杂,时间也长,我不知究竟该如何?请赐教!
我觉得如果在前列腺组织块含量高就不需要表达,如果不高那就表达,但是我觉得最简单的方法还是提取,毕竟表达也天然的蛋白有时候是不一样的,何况也不是所有的表达都好做,所以我觉得能提取还是提取的好.
37)请教chromatography兄,我是一个新手,欲纯化一个嗜盐性的酶,该酶至少需1M的Nacl才能有活性,请问我该如何设计纯化方案?
那只好用疏水了,我记得当初中科院微生物所的我的校友用的就是我们的苯基琼脂糖凝胶,硫酸铵沉淀,过疏水.
最好优化你的纯化条件,没有必要再去做别的纯化,实在没有办法再做,否则浪费时间不说就怕效果也不一定好,何况凝胶过滤处理量很小,不知道你用的什么方法纯化的,线粒体蛋白量有多大,杂质有多大.线粒体蛋白有什么特性.
39)我有一个GST融合蛋白,量大概60KD,经亲和层析纯化后,SDS电泳检测,有3条主要的蛋白带(也有其他的杂蛋白带),最浓的是我得目的蛋白,但是另外两条带的浓度也很大,这两条带的大小加起来差不多是目的蛋白的大小.试了两次都这样.我想请问这到底怎么回事?是目的蛋白降解的还是其他的杂蛋白?如果是降解的,如何确定?为什么亲和纯化效果会这么差那?
我是蛋白领域的生手,正在为这个问题困扰不安,正好发现了chromatography 的帖子,请多指教!我已经在这个问题上了很长时间了,所以很着急,能不能帮我想想办法?谢谢!
怀疑是降解,你查查以前的帖子,你用GST抗体WB做看看有几条,如果还是那是降解,如果不是,那就没有,在纯化的平衡缓冲液中加0.5M盐,看能不能去掉杂带,此外可以用不同浓度的GSH洗脱试试,破碎的时候超声别太强,时间别太长.也可以加点酶剂试试
40)我使用的蛋白纯化系统使AKTApurify100,刚刚在用superloop进样时不小心把进样方式设成了system pump进样,结果成了A2泵进样,而由于这台机器长期没有人使用了,A2吸头所在的溶液中长菌,管中有气泡,进样后导致系统压力增加一倍,请问是否是菌体堵塞柱头所至,另外如柱子里有气泡的话有什么可见的表现形式?是否压力上下跳动不稳?我用的是自己填装的SUPERDEX75,柱子使XK1.6x100cm,压力现在在0.13-0.15兆帕间不停跳动(原来是0.6兆帕),这正常否?另外,我现在的流动相是PBS,是否可以直接换成20%乙醇将柱子反过来冲?盼指点,谢谢
我觉得如果你的A2输液管由于堵塞,才会造成你说的这样压力不稳定,如果真的是进空气或者堵了,那你的柱子后面应该没有液体流出来,所以关键是先把A2输液管的头清洗,然后用20%乙醇作为溶液,再用排气用的注射器抽掉空气,然后再清洗泵,这样就可以,柱子里面应该没有空气,所以和柱子无关.我推断你A2管道中有空气,根本进不了液体,所以应该没有关系,按我说的去处理,应该就可以.
谢谢你的回复,但我只是进样方式设置成了A2泵进样,进样完成后还是A1泵恒流速泵入流动相,而A1泵的吸头和整个管都是干净的,这时压力仍然是0.15MPa,而且今天早上已经上升到了0.17MPa(装完柱子测柱效时是0.06MPa),这是否意味着柱头有堵塞但未完全堵死?
最好清洗一下A泵,这样也许好点,此外你最好用A2输液管清洗,压力其实是有波动的,没有关系.当然为避免有东西进柱子,你也可以倒冲一下柱子,压力也随液体的黏度不同而变化,所以有时候压力不高也不一定说明堵,例如水的黏度要大于20%的乙醇,你装柱用的是20%乙醇,自然压力小,而用缓冲液压力要比装柱高也是正常的,只要不是一直往上升高就没有问题.
装柱后一直是用水平衡的,压力在0.08MPa,准备进样时换用PBS,因有少量盐导致压力降低到0.06MPa,可自从A2进样后压力就是0.14MPa左右的样子了,我已经将柱子反冲.
41)1.我买了25mg RNase A,要求在4摄氏度下贮存,我想取出10mg,当拿出冰箱时,会有水汽马上附着于瓶上及药品上,药品都被吸潮了.有同学我等放置到室温下再取用.我该怎样取用?我怎样称量?药品在小瓶里看起来太少了,怎样取出来,那瓶是带盖的小瓶吗?
2.我用RNase A 偶联Sepherose 6B,要求在4摄氏度下搅拌20小时,很难实现,有没有好办法?在冰箱里放不进去搅拌器.我想用冰块冷却,然后放在水平的那种摇床行吗?
6.我用WHATMAN的DE52做预纯化,每次用完以后用含 2M NaCl 的tris缓冲液冲平后在进行下次使用可以吗?我的意思是每次使用后用不用NaOH和HCl再生?是不是上次用完后冲平就可以下次使用,当使用不同的缓冲液时才可以?我每次都用的都是相同的缓冲液.
1. 放到室温是不错的做法,但是10mg太少了,很难做1ml的填料吧.取的话用一个硬纸条对折,用这样代替药勺应该可以,要不就找掏耳朵用的小勺：).
6. 用完最好用NaOH再生完,再水冲,保存在你的保存液体中,这样可以下次性能相同,如果不洗怕有吸附蛋白影响填料的载量42)我是一位新,也是搞蛋白分离纯化与复性的.我干了一年多,感觉很难,没想到您做起来是这么的轻松,很是.我是在读硕士,想要考博士,还想继续这方面的研究,您能给我推荐一些这方面的导师和学校吗?还有,这个专业的前景如何,还想要请您指点一下.
其实复性是比较难,我做得不多,纯化也许我的运气要好点,而且关键是我们的填料很多,要什么都有,所以好办,此外我们也可以自己合成,所以不存在填料的.柱子也各种都有,导师我觉得你可以考虑中科院过程所生物工程国家重点实验室苏志国教授,我在那里工作过,觉得还不错,别的地方我也不熟悉,我觉得纯化还是有前途的.只能提供这些消息.
43)我用携基因的线T细胞,然后收集上清夜,收集蛋白,我的蛋白是糖蛋白,请问一下,怎么浓缩提纯我要得蛋白,前提是保持蛋白的活性,我看了好多书,怎么也不懂,向您请教一下.麻烦您详细回答一下.
浓缩可以直接过离子交换或者亲和,这样不需要浓缩样品,如果你的糖蛋白是葡萄糖残基,那也可以用刀豆球蛋白A琼脂糖亲和柱子去纯化.
45)我做的是从霉菌的发酵液中提取量小于是10KD的蛋白质.最好是能在1~2KD之间,我想请教楼主怎样做合适.我的邮件地址是谢谢!
这样小的多肽最好是用反相色谱去制备,这是最快的方法,如果没有条件,那就先超滤,然后再进一步纯化,方法可以用离子交换,反相,疏水.
46)本人也做过多年纯化,但是很惭愧,经验还是少得很.我目前正在作产品研究,正像你说的那样,确实也是难度很大,我目前最大的问题也是一个酸性蛋白的去热源问题,对你的除热源柱非常感兴趣,请把这方面的资料包括价格给我一份吧.还有,我希望能有34um的敖和介质,不知你们能不能做,PHARMACIA的是太贵了.还有GLUTATHIONE 亲和介质.当然,我使用的介质很多,其他你们有的介质资料也发给我吧.
你别客气,我其实也是和大家交流,共同提高而已, 酸性蛋白去热源和核酸去热源是一样的,都是酸性的物质, 所以想用阴离子交换的方法去是很难的, 我们用我们去内毒素的填料解决了我们核酸去内毒素的问题, 现在有几家药厂用我们的填料, 也解决了困惑他们的热源问题. 至于34um的敖和介质效果和90um的没有什么差别, 没有必要, 我用过200um的都一样用, 亲和的填料对颗粒要求不高, 如果不是用线性洗脱而改用阶段洗脱效果一样很好,这样根本不用考虑可颗粒大小,我把我们的材料发给你一份,希望有所帮助.
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