New England Biolabs,在实验室工作时间较长的人都不会陌生,特别是海归派.成立于上个世纪七十年代中期,NEB是当今全球性内切酶最重要的供应商,超过 30%已知的性内切酶是首先在NEB发现的.NEB供应的型内切酶种类足有210多种,也是最多的(目前仅有少数几个被其他公司专利的内切酶 NEB不提供,比如Stratagene独家的的DpnI),其中有130 多种重组酶――通过重组克隆技术,NEB酶产量大幅高,而且能纯化到结晶纯,质量非常稳定可靠,而且量特别足,价格也越来越实惠――NEB每次成功将一个酶重组化后,这个酶的包装就会“double”――有时同样的价格,量会加几倍.除了在酶的领域独步天下,NEB还致力于开发信号传导研究产品,专门成立的Cell Signaling Technology公司在磷酸化抗体也享有良好的声誉.虽说它叫新英格兰生物实验公司,可是不要误会,它是一家美国公司.NEB一直和中国保持良好的关系,据说过去一直定期接受中国科学家去NEB短期工作,2001年11月由NEB在中国投资的纽英伦生物技术()有限公司正式成立,据说这是为了表彰一位中国科学家的杰出贡献而首次在美国本土以外设立分厂.国内市场的要求,NEB中国专门为国内市场提供特别小包装――常规小包装的一半(反正他家小包装的量也超大的),这样单个成本就便宜多啦.
融合表达在最初的鉴定和纯化时有标签会方便许多,但是融合表达的问题是最终如何去掉外源的融合标签,特别是有可能用于医疗用途的蛋白质,往往必需去掉所有外源的氨基酸.可是在最后要除掉它的时候就会带来许多麻烦――比如要在25度用蛋白酶切割10多个小时容易引起目的蛋白变性、切割后的蛋白酶污染问题,以及目标蛋白会有残留氨基酸.为了解决这个问题,通用医疗(原安玛西亚)有在5℃下进行切割的蛋白酶,Qiagen也有4℃下进行切割的蛋白酶,这样可以最大程度地防止蛋白降解.同时Qiagen还通过基因让蛋白酶也带上标签,这样一步就可以同时把蛋白酶和外源蛋白上含有的标签一并切除.现在为你介绍NEB是怎么解决这个问题的吧.
NEB是最早开发内含肽(intein)技术的公司ein称为“内含肽”,在还原条件下、或者pH值或温度条件改变下会发生N端自剪接,兼有蛋白酶和蛋白连接酶的特性,与内含子在RNA水平自剪接的作用方式相似.
IMPACT表达的目的蛋白通过与蛋白自剪接元件intein,连接几丁质结合蛋白域(CBD)形成融合蛋白,通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白.在特定的条件下,内含肽的肽键裂解活性,将目标蛋白出来,而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质纯化介质上,达到单柱分离纯化蛋白的目的.而且,最终得到目的蛋白上不会残留多余的氨基酸.
这一系统有两个系列载体,一个是IMPACT-CN蛋白纯化系统,可利用还原剂DTT使标签自动裂解,无需外加蛋白酶切割,可以在4度条件下进行,小的还原剂也很容易去除;IMPACT-CN蛋白纯化系统包含的表达载体(pTYB载体)有两种,内含肽分别与目的蛋白的C末端(pTYB1和 pTYB2)或N末端(pTYB11和pTYB12)融合.这种在融合蛋白构建方面的机动性极大优化了目的蛋白成功表达和纯化的能力.pTYB2和 pTYB12载体的多克隆位点区设计了相同或者可兼容的酶切位点,使得目的蛋白可选择任一种融合构建载体.而pTYB1及pTYB11载体可让目的基因与内含肽的裂解位点直接相连,在4℃利用 DTT 内含肽的肽键裂解活性,使得最后纯化得到的天然蛋白不带有源自于载体的额外的蛋白残基,同时低温也最大程度地了蛋白不被降解.
但是如果目标蛋白的二硫键丰富,还原剂的使用可能影响二硫键稳定,NEB推出改良的IMPACT-TWIN 蛋白纯化系统,这个更加创新的方法,可以调整pH值(pH6-7)和温度改变intein自动裂解,同样不需要蛋白酶参与.这个温和、经济、操作方便的蛋白纯化方法更能适应工业化生产控制,有很好的工业化前景.IMPACT-TWIN系统包括两个大肠杆菌表达载体――pTWIN1,pTWIN2.之所以叫做Twin,原因在于pTWIN的设计在多克隆位点两端都各有一段intein和CBD,排列如下：几丁质结合蛋白域―intein1―MCS―Intein2―几丁质结合蛋白.这个巧妙的设计有3重便利：N-端,C-端或者N-端和C-端同时融合短的内含肽序列.想做N端融合,你可以将目的基因替换MCS―Intein2―几丁质结合蛋白,如果想做C 端融合表达,就可以将目的基因替换MCS前面的几丁质结合蛋白域―intein1―MCS,不用分2个载体;而且做过克隆的人会很有体会：很多时候双酶切载体,由于2个酶切位点都多克隆位点上,没有小片断切下来,所以是否成功双酶切就不好判断,如果用Twin载体就会切下一个片断,更方便判断.pTWIN 最巧妙的不仅于此,更重要的是还可以将目的基因直接克隆到MCS位点上,得到两端都带有intein和CBD的融合蛋白――内含肽融合在目的蛋白的C- 端,目的蛋白依赖巯基纯化从几丁质树脂上下来.这种依赖巯基的切割会使纯化的蛋白C-端带有一个巯基,可以用于内含肽介导的蛋白连接(IPL)反应. IPL连接反应可用于将荧光,生物素和/或非编码氨基酸序列连接到原核表达的蛋白质的C-端.另外,目的蛋白N-端与内含肽融合体可以通过改变pH或者温度使目的蛋白从几丁质树脂上下来.这种方法适用于纯化对DTT或2-巯基乙醇的蛋白.而且C-端融合可以用来纯化N-端不带有甲硫氨酸(Met)的蛋白.而目的基因插入到两个intein之间可以形成环化的蛋白,且在连接位点形成一个肽键.所以IMPACT系统除了普通的原核表达,还有数种其它用途,产生的目的蛋白可带有N末端的半胱氨酸和/或C末端的硫酯键,进行蛋白的标记、连接和环化.且不会在目的蛋白的两端增加任何载体上的残基.
pTWIN1 和pTWIN2都使用一个经遗传工程的Ssp DnaB 内含肽(154 aa)作为内含肽1,两者的区别在于使用了不同的内含肽2,pTWIN1用Mxe GyrA 内含肽(198 aa)作为内含肽2;而pTWIN2使用的是Mth RIR1 内含肽(134 aa).然而,pTWIN1 和pTWIN2含有相同的多克隆位点,这样简化了将目的基因插入两个载体来选择最佳表达质粒的操作.pTWIN-MBP融合了麦芽糖蛋白,可用作对照载体和克隆载体(将目的基因克隆到pTWIN-MBP1 NcoI-SacI酶切位点之间,会在蛋白产物的N-端增加3个氨基酸,C-端增加23个氨基酸.)
有许多人利用原核表达还是希望可以得到可溶性的蛋白,因为可溶的蛋白才可以行使功能,而且纯化起来也不像包含体复性那么复杂.pMAL™系统采用了 tac启动子(由lac启动子的-10区和trp启动子-35区融合而成,参考：如何做原核表达)和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达. pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein,MBP)的大肠杆菌malE基因,其下游的多克隆位点便于目的基因插入,表达N端带有MBP的融合蛋白.
此系统的pMAL载体除了含有氨苄霉素抗性,还含有LacZα基因,目的基因的插入导致其失活,通过X-gal平板可进行蓝白斑筛选.pMAL载体都含有一段编码蛋白酶识别位点的序列,融合蛋白纯化后,通过Factor Xa(X),Enterokinase (E)或 Genenase™ I (G)可将目的蛋白与MBP切割分离.如果不想在切割后留下任何外源氨基酸可以在设计引物时引入XmnⅠ或KpnⅠ或SnaBⅠ位点.
MBP融合表达更能提高i表达蛋白的可溶性,可是它在大肠杆菌的表达含量不如T7等系列高.形成包涵体的主要原因之一是其表达速度过快,如果大肠杆菌自身蛋白表达过快也会以包涵体形式出现.这个问题在以后的原核表达终结篇里再做详细讨论.
pMAL™系统采用麦芽糖温和洗脱,无去污剂或变性剂对蛋白活性的影响.其中的pMAL-p2X载体带有信号肽,可使外源蛋白在细胞质或周质中表达.周质表达可提高二硫键的形成,促进蛋白折叠的形成.此系统还有配套的,用于纯化的多糖树脂,它是一亲和基质,用来分离与麦芽糖结合蛋白融合的目的蛋白.
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