【摘要】目的表达与纯化结核分支杆菌katG蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础.方法将含有katG基因的pET24b-katG表达载体大肠杆菌BL21(DE3) 菌株,在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)下表达,分别对不同时间的表达产 物进行SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染 色.获得稳定的高表达菌株后采用Xpress TM蛋白纯化系统对超声破菌液进行纯 化.最后对纯化产物进行过氧化氢酶活性的初步检测.结果对后的重组大肠杆菌菌液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶电泳(SDS-PAGE)以及考马斯亮蓝染色后 发现相对质量约为80 000.表达蛋白量约占总蛋白量的17.7%.对重组katG基因表达产 物进行 纯化的结果发现,以350 mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上.对 表达产物进行过氧化氢酶活性初步检测证明,重组的katG基因产物具有过氧化氢酶活性.[ HTH〗结论通过pET24b-katG表达质粒大肠杆菌可获得基因重组的katG高表 达菌株,表达产物具有一定酶活性,经纯化后可达到较高的纯度.
异烟肼(INH)是一种最经济有效的抗痨药,几乎所有的抗痨方案中均包括IN H.结核分支杆菌编码的katG基因的突变可致结核分支杆菌对INH 产生耐药性[1].自1992年以来,对于katG基因变异或缺失造成分支杆菌对异烟肼 耐药的基因水平研究已较为深入[1,2],有必要在蛋白水平对耐药机制进行进一步 研究.本研究将含有katG基因的pET24b-katG表达载体埃希大肠杆菌BL21(DE3)菌株 ,获得稳定的高表达菌株后进一步对表达产物进行了纯化,并对纯化产物进行了酶活性的初 步检测.
(一) 质粒与菌株表达质粒pET24b-katG与埃希大肠杆菌BL21(DE3)由复旦大学遗传学研究 所惠赠.
(二) 试剂XpressTM蛋白纯化系统为美国Invitrogen公司产品;异丙基-β-D硫代 半乳糖苷(IPTG)为华美生物工程公司产品;其他主要生化试剂为美国Sigma公司产品或国内A R级产品.
(三) 表达产物的纯化采用Xpress TM蛋白纯化系统进行纯化.用无菌双蒸水悬 浮树 脂纯化柱3次.加入7 ml结合液(20 mmol/L磷酸钠,500 mmol/L氯化钠,pH 7.8),以及经IP TG不同时间后产量最高的破菌液上清5 ml,重新悬浮纯化柱.反复轻摇混合2 min.静 置10 min,吸弃上清,再加入破菌液上清5 ml重复以上步骤.以4 ml结合液重新悬浮纯 化柱 ,温和摇动混合2 min,静置沉淀,吸弃上清,共3次.再以冲洗缓冲液(20 mmol/L磷酸钠, 500 mmol/L氯化钠,pH 6.0)洗4次,分别以不同浓度的咪唑洗脱液(50、200、350、500 mmo l/L)各5 ml加入柱中,收集不同洗脱浓度的洗脱液.将洗脱液进行SDS-PAGE.将纯化后的 蛋白以85%的硫酸胺沉淀,离心后将沉淀物以无菌双蒸水溶解,4°C透析过夜.透析产物加 入甘油(40%)后贮藏于-80°C的下.
(四) 过氧化氢酶活性测定对破菌液上清进行过氧化氢酶活性的初步测定.用磷酸盐(K2 HPO4+KH2PO4,0.1 mol/L)与NaCl(2 mol/L)的缓冲液配制10%的Tween 80溶液,取 5 ml 与30%的双氧水5 ml混合.分对与katG管,在katG管内加入不同容积的含pET-katG表达 质粒的菌株破菌上清(20、40、80、160 μl),对 则加入含pET空载体的菌株破菌上清,10 min后观察气泡产生情况.如产生大量气泡则提示 酶活性较佳.
将含有katG基因的pET24b-katG表达质粒大肠杆菌,在IPTG下表达,分别对不同诱 导时间的表达产物进行SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色,可在相对质量80 000处见一诱 导表达带 (图1).比较不同时间的表达产量可以发现,经2 h后的表达产量已达到峰值.在其 后蛋白纯化中即可选取该时间的产物.对此表达带进行黑度密度自动扫描分析,此 处表达蛋白量约占总菌体蛋白量的17.7%.
采用Xpress TM蛋白纯化系统进行纯化发现,分别以不同浓度的咪唑洗脱液(50、 200、350、500 mmol/L)洗脱纯化柱后,所收集的洗脱液再次进行SDS-PAGE分析.结果发现 ,以350 mmol/L咪唑洗脱后纯化的效率最高,通过SDS-PAGE黑度密度自动扫描分析可以发 现纯化率可达90%以上.
在过氧化氢反应系统中加入不同容积的破菌上清(20、40、80、160、320 μl),比较气泡产 生情况,发现加入含pET-katG表达质粒的菌株破菌上清的各管均有气泡产生,且均较对照 管为明显,而以加入量为160 μl与320 μl的反应管产生气泡最为显著.提示重组katG表达 产物具有过氧化氢酶活性.
结核分支杆菌的katG在INH的抗结核作用机制中起着关键作用.研究表明INH实际上是一个 药物前体,需经结核分支杆菌过氧化氢酶-过氧化物酶活化后 才发挥抗结核作用,而katG则由katG基因所编码[4].有研究 通过质粒将katG基因转移到INH耐药菌株胞内,可令其对INH重新恢复性.而对结核分支 杆菌的临床耐异烟肼菌株进行katG基因分析亦发现该基因的缺失或突变是引起耐药的主要原 因[5].然而对于katG如何活化INH以及katG发生变异后导致耐药的 确切机制仍然 不清,特别是近年来对于不同突变位点变异对药物性的影响程度颇有争议[6] ,因此在蛋白水平研究katG的作用环节与耐药机制,以及比较不同位点 基因突变对酶结构与活性的影响等方面进行研究可深入了解INH耐药的发生机制,进而可 能在蛋白水平找到消除耐药的途径.由于结核分支杆菌生长较缓,而且具有较强的传染性, 长期以来在提取结核分支杆菌蛋白进行研究的进展较缓.本研究通过基因重组的katG表达载 体到大肠杆菌后产生高表达的katG蛋白,相对质量约为80 000,表达量可占总菌体 蛋白的17.7%.表明该基因重组的菌株为katG的高表达菌株,对表达产物进行初步过氧化氢 酶活性研究验证了其酶活性.进一步对表达产物进行纯化后可提取到纯度超过90%的katG蛋 白.本研究为进一步研究katG蛋白、katG对异烟肼的活化机制以及为检测katG变异耐药菌株 奠定基础,并且对深入阐明INH的耐药产生机制与寻求消除耐药的方法有较大的意义.
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