蛋白质的种类、性质、所处体系以及蛋白质分离纯化的目的不同,因此,不可能有一个固定的程序适用于各类蛋白质的分离工作.但这并不意味着蛋白质的分离纯化没有一定的规律,实际上多数分离纯化工作中都有相类似的步骤与手段.蛋白质分离纯化的一般程序：
生物体组织细胞→破碎→离心→盐析、等电点沉淀→凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析和高效液相层析.
分离纯化蛋白质首先应考虑选择适当的材料.人体的手术标本、培养的细胞、动物组织以及微生物是蛋白质的主要材料来源.选择材料要依据试验目的及遵循以下原则: 1、所含目的蛋白含量高;2、材料易得.
蛋白质含量受性别、年龄、季节、饲养条件及培养条件的影响,另外不同的生物体及同一生物体的不同组织细胞的蛋白质含量和分布有很大差异,在正常状况及病理状态下,其蛋白质的组成及含量也有很大的不同,这些是我们在分离纯化蛋白质时应注意的.材料选定后,通常进行预处理,将不必要的结缔组织、脂肪组织等在尽可能接近生命状态下剔除,处理后应立即使用或在冷库中保存.制备某些易在体内被分解的活性蛋白质、酶或蛋白激素时,一般宜用新鲜材料.
除了提取体液、细胞外某些多肽激素、蛋白质、酶不需要破碎细胞外,对于细胞内及多细胞生物组织中各种蛋白质的分离纯化,都需事先将细胞和组织破碎, 使蛋白质充分出来.不同的生物体或同一生物体的不同组织,细胞破碎难易不一,使用的方法也不尽相同,如胰脏、肝脏、脑组织一般比较柔软,用普通的匀浆器研磨即可;肌肉、心脏组织较韧,需预先绞碎再作匀浆;许多微生物都有坚韧的细胞壁,需用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波和加压处理等方法.目前已建立了很多破碎细胞,细胞内容物的方法.根据作用方式不同一般将其分为机械法、物理法电化三大类.
1、匀浆是破碎机体软组织最常用的方法之一.其原理是将组织剪切成小块,再加入3-5倍体积的预冷匀浆缓冲液,通过固体剪切力组织和细胞,蛋白质进入溶液.它是通过匀浆器来进行的.市售匀浆器有四大类：刀片式组织破碎匀浆器、内切式组织匀浆器、玻璃匀浆器及用于规模生产的高压匀浆器.实验室常用的是由电力驱动,通过调节速度完成匀浆制备的切片式匀浆器.
2、组织捣碎机方法由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃筒等部分组成.操作时,将材料配成稀糊溶液,放置于玻璃筒内约占1/3体积,固定筒上盖子,将调速器拨至最慢处,开动马达后,逐步加速到所需速度.一般市售捣碎机转速最高可达10000-20000转/分.捣碎过程注意维持低温,筒外可放置冰水浴.
3、研磨是破碎单一细胞的有效方法.借助于研磨中磨料和细胞间的剪切及碰撞作用破碎细胞.常用的磨料为沙子、氧化铝等.主要用于细菌、酵母等的破碎.(二)物理法
1、超声法输入高能超声波可以破碎细胞,其机理与超声波作用溶液时的气泡产生、长大和破碎的空化现象有关.空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞裂解.超声波破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等.超声波破碎在处理少量样品时操作简便,效率高,液量损失少,适于实验室使用.但应注意的是超声波产生的化学基团能使的活性物质变性失活,另外噪声也比较大.
2、反复冻融法 把待破碎样品冷至零下15℃-20℃,使之冻固,然后缓慢地溶解,如此反复操作,大部分动物性细胞及细胞内颗粒可被破碎.由于在此过程中易使活性蛋白失活,故适用于提取非常稳定的蛋白质.
3、冷热交替法 将材料投入沸水中,在90℃维持数分钟,立即置于冰浴中,使之迅速冷却,绝大多数细胞被,一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质.4、低渗裂解法 是指无胞壁细胞在低渗溶液中,通过渗透张力作用裂解的方法,常用细胞的裂解.
1、有机溶剂法 有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性,使内含物有选择性的渗透出来.丙酮也是常应用的有机试剂,它不仅可以有效地破碎细胞膜,而且可以制成具有蛋白活性的干粉,即丙酮粉,它能长时间保存,另外它还可以脱去脂肪,便于后续的抽提.
2、表面活性剂 较常用的有十二烷基磺酸纳(SDS)、Triton X-100、NP-40和脱氧胆酸等.
3、酶解法用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法称为酶解法.利用此法处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶.常用的有溶菌酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶等.细菌主要用溶菌酶处理,酵母需用几种酶复合处理.酶解时应注意控制温度、酸碱度、酶用量、先后次序及时间.
蛋白质的分离纯化是根据其溶解度、大小及形状、电离性质、生物学功能的差异而进行的,常用的分离纯化方法有：
盐析法是最经典的方法,现在还广泛应用,常用盐析方法进行粗分离.蛋白质在低盐浓度下的溶解度,随着盐液浓度升高而增加,此时称为盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出,称为蛋白质的盐析.这是根据不同蛋白质在一定浓度的盐溶液中,溶解度降低的程度不同而达到彼此分离的方法.
1、透析和超滤透析和超滤是利用蛋白质不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其它小物质如无机盐、单糖、水等分开.透析是将待提纯的溶液装入半透膜的透析袋内,透析袋置于蒸馏水中,更换透析外液,直到透析袋内的无机盐等小物质降到最低为止.超滤是利用压力或离心力,水和其它小溶质通过半透膜而蛋白质则保留下来.可以选择不同载留量的超滤膜,将量不同的蛋白质分离.2、离心法 根据蛋白质大小、形状不同进行分离的技术称为离心法.离心法主要包括差速离心法和速度区带离心法.
(1)差速离心法: 逐渐增加离心速度,可以使样品中沉降速度不同的颗粒逐步分离开来.该法主要适用于量或沉降系数相差较大的颗粒,一般用作粗分离,如从组织匀浆液中分离细胞器及分离病毒.
(2)速度区带离心法: 又称为沉降速度离心法.混合样品中不同蛋白质颗粒的大小和沉降速度不同,在一定的离心力作用下,沉降的颗粒各自以一定的速度沉降而逐渐分开.在密度梯度介质的不同上,分别形成界面清楚的不连续区带的方法,称为速度区带离心法.速度区带离心法的沉降速度主要取决于颗粒的形状和大小,一般用蔗糖、聚蔗糖 (Ficoll)等作密度梯度介质.离心时间的选择非常重要,时间太长颗粒全部沉入管底,离心时间太短,颗粒之间未完全分开.
3、凝胶过滤层析凝胶过滤又称筛层析.这是根据大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一.在凝胶过滤中,柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物,最常用的是葡聚糖凝胶 (Sephadex gel)和琼脂糖凝胶(Agarose gel).凝胶颗粒是具有不同交联度的网状结构物,网眼大小可以通过交联剂与凝胶的比例来控制.不同型号的凝胶用来分离纯化不同大小的物质.在层析过程中,不同大小的蛋白质借助重力通过层析柱内的凝胶颗粒,比“网眼”大的蛋白质不能进入网格内,被排阻在凝胶颗粒之外,随着洗脱剂的流动首先流出;比“网眼”小的则进入凝胶颗粒内部,这样由于不同大小的所经径距离不同而得到分离,大物质首先被洗脱出来,而小物质后被洗脱出来.
根据蛋白质电荷不同,即酸碱性质不同分离蛋白质的方法主要有电泳和离子交换层析,这是蛋白质分离分析中常用的两类方法.
1、电泳在电场的作用下,带电粒子(包括蛋白质等)在电场中向与其自身所带电荷相反方向移动的现象称为电泳.移动的速度取决于蛋白质所带的净电荷性质及多少有关,也与的大小与形状有关.电泳的种类很多,有电泳、区带电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等.
2、离子交换层析离子交换层析是根据物质的酸碱度、极性及大小的不同进行分析分离的层析技术.离子交换剂是通过化学反应,将带电基团引人到惰性支持物上形成的,如带电基团呈正电,则能结合阴离子,称为阴离子交换剂.由于被分离的各种离子所带电荷的多少不同,它们对交换剂的亲和力就有差异,因此经过离子的交换与洗脱过程,使不同的离子依先后顺序被洗脱下来,从而达到分离目的.
许多生物大物质,具有与其结构相对应的发生可逆性结合的特性,如酶与底物及辅助因子、酶与剂、抗原与抗体、激素与受体、生物素与抗生物素等等,间的这种结合能力称为亲和力.亲和层析就是利用生物大所具有的性亲和能力进行分离的方法.该方法常把可亲和的一对中的一方固定在不溶于水的固相支持载体上;另一方随流动相流经固定相,双方即可发生性结合.用流动相经过一段时间的洗涤,可将杂质除去,然后再利用亲和吸附的可逆特性,改用特殊的流动相,使所需分离的物质被解离下自来,从而得到纯化物质.亲和层析法可在温和条件下操作,纯化过程简单、快速、分辨率高,对分离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效.五、蛋白质分离纯化的条件
蛋白质是一类结构复杂的生物大,在细胞和抽提液中蛋白质的性状也不尽相同,离开天然,蛋白质变得极不稳定,因此从正常生物材料中提取各种蛋白质均需要特定的条件.
(一)缓冲液 缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变,选择合适的缓冲液对于维持一定pH 值下蛋白质的稳定及保验的重复性十分重要.各种缓冲液原则上都可用于蛋白质的分离纯化,但具体选择何种缓冲液要视分离纯化的目的物性质及所采用的纯化技术而定,例如缓冲液中的无机成分(磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐等)可以与酶或底物反应,从而影响酶的活性;大多数动物细胞在37℃生理状态下的pH值是 7.0-7.5之间,因此应选择相应的缓冲液;对凝胶过滤方法,大多数缓冲液均可适用;离子交换层析中的阴离子交换层析,阳离子缓冲液首选Tris缓冲液,阳离子交换层析,阴离子缓冲液首选磷酸缓冲液.在选择缓冲液时,最好对pka相近的一些缓冲液进行比较试验,以避免有的缓冲液与所研究的蛋白质之间发生不良的相互作用,影响蛋白质的分析分离.
(二)盐、金属离子和整合剂 大多数蛋白质如球蛋白,在稀盐溶液中才能溶解,因此应采用含盐(氯化纳)缓冲液.通常用0.1-0.2mol/L NaCI或KCl来模拟生理状态下的离子强度.某些金属离子特别是二价金属如 Ca2+、Mg2++ 等往往是酶的组成部分,失去金属离子其活性会大大下降,如果这些确是我们所需要的,则应避免其与缓冲液中的成分形成复合物.但有些蛋白质含疏基,而这些疏基是活性所必须的,为减少金属离子对活性的影响,可以在缓冲液中加入金属离子的螯合剂(Chelate)除去这些金属离子,如Zn2+的螯合剂为邻二氮杂菲;Ca2+的螯合剂为乙二醇双(2-氨基)四乙酸(EGTA);重金属及其它金属离子为乙二胺四乙酸(EDTA).
(三)还原剂 细胞内有许多种还原成分,一旦细胞破碎,由于和氧的接触以及稀释作用而使抗氧化成分减少,导致许多蛋白质被氧化而失去活性,如巯基蛋白,一般应加入一些还原剂.如抗坏血酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)可以有效防止上述的氧化过程.
(四)去垢剂 去垢剂为双极性,可在水中溶解.除胆酸盐外,去垢剂通常是由线性或带有分枝的碳氢化合物尾部和结构各不相同的亲水性头部组成.去垢剂的一个重要特性就是可以形成团结构.当膜蛋白与去垢剂接触时,膜蛋白的疏水区或穿膜区被去垢剂覆盖,成簇的去垢剂将亲水性头部向外,使其能与水溶性缓冲液相溶.另外,去垢剂形成的微胶粒量对于透析、凝胶过滤层析、非变性电泳都常重要的.为了使蛋白质更好的溶解和保持蛋白质的活性,需选择合适的去垢剂.如溶解膜蛋白可选择TritonX-100;1-3%浓度的TritonX-100能使许多蛋白质活性保持不变;Tween-20通常用在固相免疫细胞化学反应(如ELISA、RIA、免疫印迹等)中用来阻断非性蛋白之间的相互作用;SDS等离子型去垢剂由于可使蛋白质以单体形式被分离,常用于蛋白质量的测定;CHAPS常用于离子交换层析和等电聚焦电泳,含有CHAPS的蛋白质溶液可以冰冻保存.如果用不同的去垢剂均不能获得较好的结果,可以探索多种去垢剂混合使用.(五)蛋白酶剂 破碎细胞提取蛋白质的同时,会出多种蛋白酶,这些蛋白酶需要迅速被才能保持蛋白质不被降解.由于大多数蛋白酶的最适pH在3-5或更大,因此可以采用低pH条件降低蛋白酶的活性,但最重要的是加入蛋白酶剂.不同类型的蛋白酶可选用不同的蛋白酶剂,有时需要几种蛋白酶剂混合使用.
1、表面效应 蛋白质的稀溶液易于使蛋白质失活,这可能是由于玻璃容器表面效应的结果.这一作用可以在溶液中加入高浓度的其它蛋白,如牛血清白蛋白(BSA)来防止;另外玻璃表面非的吸附可损失大量的纯化蛋白(5cm2的玻璃表面可吸附1μg蛋白),在溶液中加入BSA也可大大降低这种非性的吸附作用.通常在酶活性测定中至少加入0.1mg/ml BSA,而在蛋白质储存液中则加入10mg/ml的BSA.
2、温度 除了极少数酶是在低温条件下失活,称为“不耐低温酶”,如线粒体ATP酶,大多数酶在温度高时会失活.蛋白质也一样,在温度超过30-40℃时,蛋白质变得极度不稳定,大多数会由于热变性而失去活性,蛋白质在低温时其半衰期可延长.
3、储存蛋白质短期保存(1天至1周)时,可以溶液状态在4℃保存.如需长期储存(超过1周),根据需要可以采取不同的方式,如在硫酸铵溶液中以沉淀悬浮的方式于 4℃保存;或者用硫酸铵沉淀蛋白,离心后在液氮中冷冻,然后低温保存;最好的方法是将蛋白质以冻干的粉末保存.以冰冻干燥的失水状态保存蛋白质对许多蛋白质是有利的,但冻干对于一些蛋白质会部分失去活性.另外,在保存的蛋白质中需加入甘油、白蛋白、白明胶、二甲基亚砜等惰性稳定剂,由于它们能降低溶液的极性,造成疏水,有利于蛋白质的稳定.
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