通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法.植物中克隆的目的基因被克隆到设计的质粒载体上,受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶.当需要表达蛋白时,在细菌培养基中加入IPTG来启动表达.不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列,在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便.
以pET-32a(+)为例,介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程,从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程.
性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法.一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因,克隆进T-载体,然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收.但在PCR过程中,需要减少突变的发生,可采用高保真酶,尽量减少PCR循环次数,增加模板和引物的浓度.
如果亚克隆成功,阳性菌落数远大于阴性菌落.检验子的方法很多,包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序,体外和翻译.
(2)根据自己的需要选择不同的表达载体,并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因,其中有些标签是可以去除的.
(5)T7lac启动子是严谨启动子,IPTG时可以优化最佳浓度(25uM-1mM之间)使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性.
(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体,而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白.在某些情况下,低温(15-20℃)延长时间(过夜)可以使溶解性蛋白的产量达到最大.
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