蛋白分离纯化：蛋白质的提取及粗分离

　　分离纯化蛋白质，首先要从原材料中提取目的蛋白，然后通过粗分离的方法除去大量杂质，最后进行精细分离，得到目的蛋白。本实验以新型基因重组人TNF为例阐明重组蛋白TNF的提取及初步分离。

　　TNF的提取是将发酵菌体裂解，在一定的条件和溶液中，使被提取的TNF充分出来，经离心收集混合液中提取的TNF成份的过程。含有TNF的提取溶液中，含有大量的杂蛋白，由于蛋白质在水溶液中的溶解度主要取决于蛋白质表面的水数目，即蛋白质表面亲水基团与水形成水化膜的程度和带电荷的情况，当中性盐如硫酸铵等加入蛋白质溶液时，由于中性盐对水的亲和力大于蛋白质，使蛋白质周围的水化膜减弱或消失，蛋白质溶解度降低，同时由于中性盐的加入，蛋白质溶液的离子强度发生了改变，蛋白质表面电荷被大量中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质之间互相聚集而发生沉淀。不同的蛋白质由于其带电性，亲水性等性质的不同，会在不同浓度的盐中形成沉淀。依此原理可对混合蛋白质进行粗分离。该实验中利用硫酸铵盐析除去大部分杂蛋白从而使TNF得到初步纯化。

　　2.按0.5~1mg/g菌体加入用STE溶液新鲜配制的溶菌酶溶液，用玻璃棒用力搅匀后于4℃中放置20min。此时菌液呈粘稠状。

　　6. 取离心上清，精确量取其体积，测定蛋白质浓度，倒入置于冰浴的烧杯中，边搅拌边缓慢加入固体硫酸铵使其达到50%饱和度。待固体硫酸铵安全溶解后，静置于0℃中30min。

　　加入硫酸铵不论是固体硫酸铵，还是加入饱和硫酸铵溶液，加入时应边加入边搅拌，特别注意① 加入硫酸铵要慢，因为太快会引起蛋白质发生共沉淀，加入固体硫酸铵先要将硫酸铵研磨成粉末，加入饱和硫酸铵溶液时要一滴一滴地加入;② 搅拌要慢，搅拌剧烈，蛋白质溶液容易起泡沫，由于表面张力效应会引起蛋白质变性。