蛋白分离纯化：重组蛋白在i中表达及纯化

　　将目的基因连接在表达载体后,通过加入剂IPTG目的基因表达.表达载体除具有蛋白表达所需要的 启动子外,在终止子前有6个His编码序列,便于蛋白的亲和层析纯化.

　　亲和层析以蛋白质或生物大和结合在介质上的配基间的亲和力为基础.本实验采用磁座和结合有Ni2+的磁珠在变性或非变性条件下对融合蛋白进行分离纯化,只需通过“结合-清洗-洗脱”三个简单的操作步骤就可完成.该系统可根据样本量灵活调整磁珠用量,从而进行小量和大量蛋白纯化,并且磁珠可以再生使用.

　　PBS缓冲液清洗一次后同样条件离心后再次收集菌体.每3ml菌液的菌体加入0.4ml结合液悬浮.

　　1. 将瓶内磁珠轻轻摇匀,取出200 μl(含50 μl净磁珠)到离心管中,将离心管插入磁座,磁力吸附约1分钟,弃除所有上清液.

　　2. 将离心管从磁座上取下,加入1 ml结合液,盖好盖子,摇匀磁珠后,插入磁座,磁力吸附约2分钟,弃除所有上清液.

　　4. 将离心管从磁座上取下,加入预处理好的样本,盖好盖子,摇匀磁珠后,室温下轻轻摇动10分钟.

　　6. 取下离心管,加入1 ml清洗液,盖好盖子,摇匀磁珠后,轻轻摇动1分钟后插入磁座,磁力吸附约3分钟,弃除所有上清液.

　　8. 取下离心管,加入150μl洗脱液,轻轻摇动5分钟,插入磁座,磁力吸附约3分钟,将上清液转入到新的离心管中.

　　(2). 用5倍净磁珠体积的2M NaCl重悬磁珠,室温摇动1分钟后,插入磁座至溶液,弃上清.

　　(3). 用5倍净磁珠体积的1M NaOH重悬磁珠,室温摇动5分钟后,插入磁座至溶液,弃上清.

　　(5). 用5倍净磁珠体积的70%乙醇重悬磁珠,室温摇动1分钟后,插入磁座至溶液,弃上清.

　　(8). 用4倍净磁珠体积的100mM NiSO4重悬磁珠,室温摇动5分钟.若接着要进行蛋白的分离纯化,将离心管插入磁座弃上清,用5倍净磁珠体积的结合液平衡三次后即可使用;若不进行蛋白的分离纯化,将装有磁珠和溶液的离心管竖直储存于2～8℃.