该技术的原理及过程主要为转移到NC等膜上的蛋白带。用其它蛋白作为封闭液，将膜上余下的其它蛋白可结合点封闭。加入与待检测目标靶蛋白有性的第一抗体，经免疫反应，一抗将与目标蛋白结合，再经用洗膜液洗涤后，膜上仅在靶蛋白上结合有第一抗体。再加入与第一抗体有免疫性的二抗，使之与一抗反应，反应后，经洗膜液洗涤，二抗就仅存在于结合靶蛋白的一抗上。因为这种二抗都为酶标抗体，所以通过酶标反应，在显色液中，膜上结合靶蛋白-一抗-二抗的即将呈现一定的颜色。
NC膜与蛋白质的结合无任何性，因此作为性检测靶蛋白的探针-一抗蛋白也能与NC膜结合，而一旦这种结合情况发生，当加入二抗后，背景上将出现许多非性条带，而则势必造成目标蛋白的不可检测性。因此Western印迹技术的性、可行性将取决于能否对NC膜上一些蛋白质潜在结合位点进行有效封闭。在实际操作中这些结合位点一般用脱脂奶粉封闭，也可用血清白蛋白封闭。如果操作中加蛋白封闭后，非性背景仍很大的话，则可在封闭液中加入Tween20，Tween20的存在，能降低背景噪声，且不影响抗体与靶抗原的结合。
将A中经电转移并干燥的NC膜放于一平皿中，加入封闭液(液面需盖过胶面)室温下轻轻遥荡2-3小时。
一抗的稀释：将第一抗体用封闭液稀释，稀释度由预实验确定，但可参考下列数据：多克隆抗体，1:100-1:5000 培养的杂交瘤细胞上清液，1:100 鼠腹水细胞1:1000-1:10000
注意，在室温下，延长反应时间，可增加靶蛋白的可检出量，但也会增加非性结合，加大背景噪声。
3) 将膜放入一塑料袋中，加入二抗溶液，加入量一般为0，1ml二抗溶液/cm2膜，封好塑料袋，在室温下轻轻震荡1小时。
a. 将膜放入碱性磷酸酶显色液(10ml碱性磷酸酶缓冲液，66ulNBT，33ulBCIP)中，室温下轻轻摇动。
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