将克隆化 基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达.这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用.大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：
易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择.但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象.
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件：
获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-表达宿主菌-靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段.
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆形成cDNA第一链,以逆产物为模板进行PCR循环获得产物.
1、载体酶切：将表达质粒用性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体段.
1、将连接产物大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定.
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作.否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点.
3、取部分液体作为未的对照组,余下的加入IPTG剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr.
1、选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑.如为方便纯化,可选择融合表达;如为获得天然蛋白,可选择非融合表达.
2、融合表达时在选择外源DNA同载体连接反应时,对和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰.
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