【 摘要 】目的进行登革病毒E蛋白区段的高效表达,制备抗原,为分析T、B细胞表位及免疫功能的研究奠定基础.方法以含有D2V E区的质粒p30.VD2为模板,PCR扩增了编码D2V E蛋白308～468aa区段的基因片段,以pMY为表达载体,构建了表达质粒pDE1,并用酶切法使之缺失跨膜区疏水aa较多的编码序列,又构建了表达质粒pDE2,分别大肠杆菌,获得了不同的工程菌株.经培养,SDS-PAGE,免疫印迹及酶联检测分析表达产物.结果含pDE1质粒工程株只能表达微量的性蛋白;而含pDE2质粒的工程菌株则能高效表达D2V性E蛋白,重组表达产物占菌体蛋白的25.31%.用4mol/L尿素溶解包涵体,上清中E蛋白纯度可达80%.以粗提物包板进行酶联检测,结果表明,该重组E蛋白具有DV 4个型交叉抗原的特性.结论缺失C末端疏水区编码序列的D2V E基因片段,可在i中获得高效表达,其表达产物具有DV属性.
由登革病毒(DV)引起的急性传染病登革热,通过蚊虫流行,人普遍易感.部分患者可出现严重的登革出血热或登革休克综合症(DHF/DSS),死亡率较高.此病世界范围流行,主要在东南亚地区.我国海南、广西等地曾流行过多次.对DHF/DSS的发病机理进行研究证明：中和剂量的抗体(Ab)可起免疫作用,而异型Ab或亚中和剂量的Ab却起增强感染作用〔1,2〕.利用单克隆抗体和生物学技术研究证明,性Ab和增强性Ab是由不同的抗原决定簇产生的〔3-5〕,但这些决定簇至今尚不清楚,给疫苗的研制带来了困难.通过对DV抗原表位的分析,寻找只产生性Ab不产生增强感染的Ab,又能激活抗病毒感染必需的性细胞免疫的重组抗原,是目前DV疫苗研究的热点.进一步研究表明DV的E蛋白基因具有高度保守的序列,既含有中和Ab的B细胞表位〔6〕,又含有T细胞的表位〔7〕.1992年Megret等所得到的性IgG识别的表位都在E蛋白的290～400aa区段的〔8〕.1996年Rothman等证明E蛋白的331～339aa的区段中含有性CD4+和CD8+杀伤T细胞的表位〔9〕.以上研究表明在DV E蛋白的290～400aa序列中可能既含产生性Ab的B细胞表位,又含性杀伤T细胞的表位,可成为研制疫苗的候选蛋白区段.本研究目的在于利用重组DNA技术研制该蛋白区段内重组抗原,为免疫学分析创造条件.
2.质粒:p30.VD2含D2V E蛋白基因片段,巴斯德研究所Deubel教授〔10〕惠赠.pMY表达质粒,本院基础医学研究所遗传室提供.
5.质粒提取、酶切、连接、、蛋白电泳和免疫转印：皆参考《克隆实验指南》〔11〕 进行.
6.引物:参考Menbl分析的D2V E区氨基酸序列〔12〕 设计了一对引物,本院放射医学研究所合成其核苷酸序列如下：
3.重组子鉴定：将表达质粒感受态大肠杆菌HB101,培养后挑子,提取质粒DNA,经鉴定大于载体质粒DNA.以子质粒为模板,用原引物作PCR扩增,仍能得到488 bp的扩增带(图2),提取DNA用E.coRⅠ 和ClaⅠ也可切出一个488 bp的片段.
4.表达产物鉴定:将工程菌过夜培养物接种LB培养基30℃培养3小时,42℃3.5小时,离心收集菌体并经裂解处理后进行SDS电泳,可见在相对质量18×103处多出一条带,经免疫印迹证明是DV的蛋白带,但表达甚微.
5.工程菌的表达质粒pDE2构建:用BamHⅠ酶切去跨膜区424～468aa的编码序列,回收段进行环化,重新构建表达质粒pDE2,E.coli BL21感受态菌,经鉴定,DNA大小和酶切片段的大小与理论值相符.重建后的工程菌,用同样条件培养后SDS电泳结果表明,有一明显可见的重组产物带(相对质量约17×103),经扫描检测,表达产物占菌体蛋白的25.31%,初步纯化结果表明,表达产物主要以包涵体形式存在.用4mol/L尿素溶解包涵体,离心上清中E蛋白的纯度在80%以上(图3).
6.抗原性分析:粗制重组蛋白包板,经酶联检测能与1～4型DV 抗体反应(表1),说明该蛋白是DV属性抗原.
根据Mandl对黄病毒属中森林脑炎病毒(TBE)E蛋白抗原结构域的分析并依据两亲性α-螺旋结构推测的T细胞表位的,我们设计并合成了一对引物,以质粒p30VD2为模板,PCR扩增得到了488bp的基因片段,构建了表达质粒,大肠杆菌获得了工程菌株,但表达甚微.经分析去掉了疏水性aa较多的跨膜区的编码序列,重新构建了表达质粒pDE2大肠杆菌BL21,获得高效表达工程菌株.由此可见,跨膜区疏水区段编码序列的存在与否,对DV E蛋白区段在大肠杆菌中的表达有明显影响.其原因可能是跨膜区疏水区的存在使E蛋白易与细胞膜结合,从而影响了细菌的正常生理功能,致使表达明显下降,此问题有待进一步分析.
抗原性分析结果表明所表达的D2V的E蛋白区段可与其它3型DV的抗体交叉,证明此蛋白区段含DV属性抗原表位.Leclerc C等报道DV的E蛋白397～413aa肽段的同源性高达81%〔13〕.同源性越高作为4型共同亚单位疫苗的可能性越大.表达的E蛋白与1～4型DV抗体酶检测中本应与2型抗体反应最强,但实验中与2型抗体反应最弱,原因是2型抗体效价低于其余3型.另外,由于酶联检测用的是粗制重组蛋白,本底较高,还需要进一步纯化与改进.本研究获得了D2V E蛋白高效表达的工程菌株,制备了重组E抗原,为T、B细胞表位的分析及其免疫功能的研究奠定了基础.
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