反相色谱(reversed phasc chromatography, RPC)是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式，任何一种有机的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高，在高效液相色谱中这是应用面最广的一种分离模式，在生物大的反相液相色谱条件下，流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液，并加一定比例的能与水互溶的异丙醇、乙腈或甲醇等有机改性剂，大量使用的填料为孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相，除此之外，也有少量高聚物微球。实验表明，烷基链长对蛋白质的反相保留没有显著的影响，但在蛋白质的活性回收上短链烃基(如C4，C8，苯基)和长链烷基(如C18，C22)反相填料是有区别的。表现在烷基链越长，固定相的疏水性越强，因而为使蛋白质较快洗脱下来，需要增加流动相的有机成分。过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸生物活性的损失。总的来说，在烷基键合硅胶上的反相色谱，由于其柱效高、分离度好、保留机制清楚，是蛋白质的分离、分析、纯化和结构阐明广泛使用的一种方法。
由于在反相色谱中，使用了乙腈、甲醇等价格高且有一定毒性的试剂，在一定程度上使该方法的使用受到。例如可使部分蛋白失活。因此，该方法用在分析鉴定方面更多一些，特别是对有机溶剂具有耐受性的样品。例如多肽样品，可用HPRPC对合成的肽huBPP进行分析。
取待分析的huBPP，称量，用0.1%的TFA液溶解，配制成浓度大于1mg/ml的液体。必要时过滤或离心。
5、平衡色谱柱 一般反相柱都保存在甲醇中，应置换出甲醇，用A液平衡色谱柱，待基线平稳后准备上样。必要时，可按洗脱条件不上样运行一遍程序，以洗出色谱柱可能存在的杂质。
⑴检查色谱柱允许使用流动相及pH，如，凝胶柱常规用缓冲液，反相柱用有机溶剂，钻石C18柱允许pH为2-7.5。
⑶ 流动相、样品使用时过滤，常用0.45μm膜，分清水溶性和脂溶性膜。一般在色谱柱口有0.2μm的膜，以免堵塞色谱柱。
⑴ 色谱柱最后封装的溶剂一般与检测报告相同或特别注明，若更换流动相时，流速要慢，一般不超过0.5ml/mim。
⑶ 注意不同色谱柱耐压程度不同，压力要在柱耐压范围内，为获得最佳分离效果，钻石C18柱使用勿超过200bar(300psi)。
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