经醋酸纤维、琼脂(糖)、聚丙烯酰胺电泳分离的各种生物需用染色法使其在支持物相应上显示出谱带,从而检测其纯度、含量及生物活性.蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方法,现分别介绍如下：
染色液种类繁多,各种染色液染色原理不同,灵敏度各异.使用时可根据需要加以选择.常用的染色液有：
考马斯亮蓝R250的式为C14H44O7H3S2Na,MW=824,λmax=560-590nm.染色灵敏度比氨基黑高5倍.该染料是通过范德瓦尔键与蛋白质结合,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色,但蛋白质浓度超过一定范围时,对高浓度蛋白质染色不合乎Beer定律,作定量分析时要注意这点.
考马斯亮蓝G250比CBB R250多二个甲基.MW=854,λmax=590-610nm.染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.其优点是在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地使蛋白质染色而几乎无本底色,所以常用于重复性好和稳定的染色,适于作定量分析.
将凝胶先置于平皿中,用5%乙酸固定20min,用H2O漂洗吹干后,再用油红O应用液染色18h,在乙醇∶水=5∶3中浸洗5min,最后用蒸馏水洗去底色.必要时可用氨基黑复染,以证明是脂蛋白区带.
将2g苏丹黑B加60ml吡啶和40ml醋酸酐、混合,放置过夜.再加3000ml蒸馏水,乙酰苏丹黑即析出.抽滤后再溶于丙酮中,将丙酮蒸发,剩下粉状物即乙酰苏丹黑.将乙酰苏丹黑溶于无水乙醇中,使呈饱和溶液.用前过滤.按样品总体积1/10量加入乙酰苏丹黑饱和液将脂蛋白预染后进行电泳.此染色适用于琼脂糖电泳及PAGE脂蛋白的预染.
核酸染色法一般可将凝胶先用三氯乙酸、甲酸—乙酸混合液、氯化高汞、乙酸、乙酸镧等固定,或者将有关染料与上述溶液配在一起,同时固定与染色.有的染色液同时染DNA及RNA,如stains-all、溴乙锭、掊花青-铬矾法等,也有RNA、DNA各自特殊的染色法.
(1)荧光染料溴乙锭(ethidium bromide简称EB)：可用于观察琼脂糖电泳中的RNA、DNA带.EB能插入核酸中碱基对之间,导致EB与核酸结合.超螺旋DNA与EB结合能力小于双链开环DNA,而双链开环DNA与EB结合能力又小于线性DNA,可在紫外分析灯(253nm)下观察荧光.如将已染色的凝胶浸泡在1mmol/L MgSO4溶液中1h,可能降低未结合的EB引起的背景荧光,对检测极少量的DNA有利.EB染料具有下列优点：操作简单,凝胶可用1-0.5μg/ml的EB染色,染色时间取决于凝胶浓度,低于1%琼脂糖的凝胶、染15min即可.多余的EB不干扰在紫外灯下检测荧光;染色后不会使核酸断裂,而其他染料做不到这点,因此可将染料直接加到核酸样品下,以便随时用紫外灯追踪检查;灵敏度高,对1ng RNA、DNA均可显色.EB染料是一种强烈的诱变剂,操作时应注意防护,应戴上聚乙烯手套.
(2)焦宁Y(pyronine Y)：此染色料对RNA染色效果好,灵敏度高.TMV-RNA在2.5%PAAG,直径为0.5cm的凝胶柱中检出的灵敏度为0.5μg;若选择更合适的PAAG浓度,检出灵敏度可提高到0.01μg;脱色后凝胶本底颜色浅而RNA色带稳定,抗光且不易退色.
(1)甲基绿(methyl grenn)：一般将0.25%甲基绿溶于0.2mol/L pH4.1的乙酸缓冲液中,用氯仿抽提至无紫色,将含DNA的凝胶浸入,室温下染色1h即可显色,此法适用于检测天然DNA.
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