1) 整理出两组玻璃片及白板铸胶组合,先用酒精拭净,并选择合适的间隔条(0.75 mm) 组合起来.请熟悉铸胶三明治组合的正确组装方式,以免灌入的胶液漏出来.
2) 三明治组合后直立站好,准备所要浓度的SDS 胶体溶液如表4.2. 两片0.75mm 厚的平板约需10 mL 分离胶体溶液,以及5 mL 焦集胶体溶液.APS液到最后才加入,未加APS 以前可在真空中抽去溶液中的气体.
3) 以上分离胶体各成份在小烧杯中混合均匀后,可直接沿着玻璃一侧倒入铸胶组合到预定高度 (约八成高),勿陷住气泡;再轻轻加上一层isopropanol. 也可使用滴管慢慢加入胶体,同样勿注入气泡.
4) 约30 min 可凝结,以滤纸吸去isopropanol,同法倒入焦集胶体溶液,要加到满;尽快插入样品槽齿模,注意不可有气泡陷在胶体中.一般在凝胶完成后,胶体与所加的水层的间,会出现清楚的直线界面,但因为背景为白色,较不易观察的.
5) 再度凝结后取下齿模即可使用.若不立刻使用,则把整个组合用保鲜膜包好,胶面上方加一水层,勿使干掉,在4℃约可放1~2 周.电泳方法︰
6) 若组合保存于4℃,则要等待完全回复室温,才架到电泳槽.一定要完全回温,否则在进行电泳时,玻璃会因热胀而破裂.
7)取F液稀释成一倍溶液,并加SDS成为0.1%;先倒入下方的正极槽,注意不可有气泡黏在胶体,然后倒入上方的负极槽.用微量针筒或微量移液器一个一个清洗样本槽,除去残留在槽内的胶体(刷牙).刷牙的动作很重要,而且要彻底,否则注入样本时,会有烦.又因为白色氧化铝板乃白色背景,不容易看出样本槽的,可用Hoefer 所附的透明样本槽模板,作为,顺便可样本添加的动作.
8) 取蛋白质样本溶液,加入同体积E 液,以及适量追踪染料bromophenol blue,混匀后在100℃加热10 min.放冷短暂离心后即可依次以微量移液器注入样本槽,样本体积可自斟酌,但要记好及体积;通常都使用5~15uL.注入样本时,尽量把针头或吸管伸到样本槽底部,但不要触到样本槽底的胶面,则可以使得样本所占的体积最小,分离效果较好.
9) 装上电源盖,以100~150 V进行电泳,最高可加至200 V,视实验的紧急程度,以及发热的情形而定.通电后两极附近会立刻产生无数细微气泡,是通电的特征.
10) 追踪染料很快进入胶体,开始焦集成蓝色细线 h 可泳动到底边,中止电泳,除去电源盖.有些量较大的样本,或使用浓度较高的,可以等到蓝色细线泳出胶体才停止.
11) 取出组合,使玻璃板向上,先除去两侧间隔条,再以扁形药匙轻轻撬起玻璃,则留在白板上.切除焦集胶体,并在分离的右上方截角做记号 (区别的左右).
12) 取染色盘 (大约比稍大),倒入CBR染色液,在染色盘上方把上述白板倒翻过来,一角,利用重力使掉落到染色缸中.若要进行蛋白质转印,则不能染色,要浸入转印缓冲液中.
13) 在CBR 中染色约30 min,染色盘要加密盖,置于旋转平台慢速50 rpm 摇荡的;要注意是否完全没入染色液中,否则会造成染色不均匀.14) 染色后小心把CBR 染剂倒回原来瓶中,整块变成蓝色,先用自来水洗掉的染色液,再倒入约20 mL 脱色液,加密盖后再放回旋转平台摇荡.染色脱色过程请戴手套,否则会在上留下指纹.
15) 的蓝色背景渐渐脱掉,待脱色液转成蓝色后,可以换新脱色液;如此脱色数次,在一小时内应可看到蛋白质的蓝色色带出现.用过的脱色液,请回收倒在有机溶液的废液桶中.
16) 待背景完全透明后,染色脱色完成.倒去脱色液,改用50%甲醇液洗一两次,待缩至大约原来的尺寸,则可准备干燥的.
17) 把玻璃纸cellophane 先用水浸湿,平铺在干燥用的玻璃片上,玻璃纸会比玻璃片大,因此四周有多出来的部份.
18) 把平铺在玻璃纸中央,与玻璃纸间不要有任何气泡. 除了气泡的外,若没有回复原来的大小,或者的四边有伤痕,都很容易造成干燥后的龟裂现象.
19) 在上再加一层浸湿的玻璃纸,也不要陷有气泡在内;把玻璃纸多出来的部份反折到玻璃背面,用手抹平表面水份,并用纸巾吸干.
20) 把此干片三明治组合放在桌上,次日即可得到已经干燥好的,用电风扇或冷气机吹的,可以加快干片速度. 干片后用指甲尖轻敲,若还可以看到指甲所留下的痕迹,表示并未完全干燥,要再等候.
21) 待完全干燥后,以美工刀或剪刀去除多余的玻璃纸,再加以护贝,则可永久保存的.免疫染色的转印纸,也可以护贝保存.
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