我注意到本版关于背景深的问题有不少战友提出过疑问,希望有经验的战友能够献计献策,指出对可能的原因,提供自己试验中消除背景的具体方法.帮助大家共同进步.
上样蛋白量30 60 100 ug,4度封闭过夜(包括室温下2h+过夜),一抗室温1h,二抗室温1h, ECL显色结果背景都很深,整个膜都很亮.而目的条带都相对很浅,时间从几s到1min,目的条带都很细.开始考虑是封闭不好的原因,过夜封闭+室温2h还不行.
考虑上样量太高了,做了一次预试,发现上样量10ug,看不到目的条带;20ug稍微有点影子;感觉30ug还可以,不能再少了.
考虑缩短抗体孵育时间和浓度.一抗用的是1：1000(santa cruze抗体稀释范围的最大值);二抗用的是1：10 000.
你的ECL工作液孵育完后有没有用吸水纸吸取多余的工作液?你的整个膜都很亮,怀疑是否发光底物液残留太多.
个人觉得你的封闭应该可以(我都用室温2小时),一抗可以试着降低浓度(但你的背景那么高,觉得跟一抗关系不大),二抗1：10000也可以了.漂洗液加Tween了吗?封闭液、稀释液都用含Tween的漂洗液配,有助于降低背景.
当然不能洗掉ECL工作液啊,只是用吸水纸把多余的吸去.另外,加完HRP-二抗后还是尽量多漂洗,我一般洗4-5次.不过没遇到过你这样高的背景的情况.希望你能找到不一样的原因.
ECL工作液体之所以发光,是因为二抗孵育后,没有洗干净,还有未结合的二抗与工作液反应显色.但是,如果洗的足够充分的话,工作液在暗室中是看不到的(没有颜色).
我试过,当5min*3次洗脱时,ECL残留的工作液确实有荧光;但是,当我洗脱10min*3次时候,在暗室中ECL工作液就看不到光了.
个人认为你可以以30ug作为上样量,但是可继续提高一抗稀释比例(特别是如果你采用的是GE的ECL底物)1：3000,一抗牛奶4度过夜,二抗室温1h,依你的膜大小,考虑加ECL底物300ul-500ul
我们这里这段时间也出现了这种情况,我们用的一抗是杂交瘤上清,出来也是背景很高,其它的和楼上说的基本相似.也很想搞清楚是什么回事.
我们这里这段时间也出现了这种情况,我们用的一抗是杂交瘤上清,出来也是背景很高,其它的和楼上说的基本相似.也很想搞清楚是什么回事. western显影常见现象、原因及解决方案
近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子,发现在这一块还没有比较系统的论述.特贡献了western显影常见问题及解决方案,是我的经验总结,以供大家参考.其中绝大部分问题是我所遇到过的,其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书.限于字数,语言比较简洁,如对其中内容有疑问或可跟帖.
Western荧光检测取决于抗原含量—一抗度—二抗度—底物度—显影和定影效率这一系统.我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10s~30s,看不到则同时压两张,10s~8min洗一张,如果无则再补一张,1h后洗.再无,则压过夜.共3张片,根据每次结果调整.
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长2"3厘米的片子(以供贴胶带),然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边(贴时胶带留一半用于粘到封口膜上),然后将片子压到膜上,并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上.这样就固定了第一张,就不会因为放、取第二张而使第一张移动了.然后放第二张,与第一张片子贴在一起就行,注意片子要干燥,压片前用纸擦干封口膜,以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起.取时用手轻轻拂过就可以把片子与下面一张错开了,不要用手抠,否则下面一张也移动了. 在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带,否则在胶带的地方会影响显影.荧光经过下面一张会稍微有些衰减,所以下面一张感光稍微比一张强一些.
反影(白色条带,黑色背景)--1 HRP过高(背景较高) - - 至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1
显影后膜上条带处变为--2 HRP过高(性太高)--至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2
信号弱或无--3 HRP过高引起底物迅速耗竭- -至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3
*注1 其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭,则不发光不使感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使感光为黑色.这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下.如果没有背景则就是原因3的现象.在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗.如是则要么通过降低抗体解决,要么动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题.也可以过一段时间HRP稍减后重加底物迅速压片.还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,原因和的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带,但与的区别主要在于性要好一些,若继续发展则就是原因3的现象.其分析和解决同上.
*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在,只是一种现象,在压过的膜可以看出来(只在加底物后一段时间出现,几小时后可能不会消退,有时甚至刚加底物1~2min就可以看出来,所以要把握时机).如果没有达到原因1和原因3的程度,那么这种情况一定能够看到很强的荧光,是一种良好的状态,是我们所的.如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理.但因为荧光太强极易导致条带增粗变大,所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决,一般压5s~10s,甚至可以3~5s,即时根据结果在暗室调整,荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好.但也有这种情况,就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大(如果时间过短如1s~3s则可因感光不足导致条带太淡,这样就不可取了,但依然是粗大的、非条带的本来面目),那么如果想获得漂亮条带则必须通过降低抗体浓度(减少上样量很不稳定且能力有限,故很少使用)来解决.原因1和3若如是则解决也是一样的.
*注3 这是与1类似但抗体性较好时的一种表现,经常与下面的原因4、5、6混淆,特别需要注意.主要出现在HRP极高的情况下,来不及压片就已耗竭底物,往往伴有原因2的现象.可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定,也可以根据原因2的现象确定,以区分于原因4、5、6.除非动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题.也可以过一段时间待HRP稍减后TBST简单洗膜重新加底物压片.这种情况下一/二抗稀释可高达10倍而依然荧显.
*注4 提高抗体上样量以及下述的使用底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述,只提醒一下随抗体浓度增高背景和非性可能会增加.关于上样量的极限在此发表我的看法：对于裂解的混合蛋白以上样孔底面积(平方毫米)乘30ug作为极限上样量,而落实到每一个具体条带(同一量的所有蛋白或仅做单一蛋白电泳),则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量.(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章),超过此量可能会导致条带变形.条带信号弱可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用底物/延长压片时间解决.但实际上样量的极限并不以我说的极限上样量为准,因为这个极限上样量是确保所有量的条带都跑的很漂亮的极限,而上样超量的表现是随量的加大变形的条带由低量逐渐往高量延伸.所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限.比如对于150kd,完全可以超出我所说的极限上样量的2倍而不变形(此时中低量条带早已融合或挤为棒槌形了)
*注5 对于非小量尤其是大量(大于100kd)蛋白而言,一般不会出现过转情况,转膜不充分是主要原因,增加转膜力度无非是加大电压/电流,延长时间.但对于小蛋白(小于30kd就要注意了,15kd尤其要当心)很可能出现过转,丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认,没有丽春红也可以考染转膜后的胶,如果是一片空白,则要小心了,可适当降低转膜力度.对于低量一般转膜液不要加SDS以防过转,《抗体技术实验指南》提供的针对中低量的湿转缓与高量的相比也是不含SDS的.
*注6 测试HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul,加入1ul HRP偶联二抗,若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好.此外试剂公司还开发一些超级底物,其度可达到pg级,但价格昂贵,对某些表达较低的蛋白效果会好些,而且也超级省抗体(其推荐抗体稀释比高达1:10,000以上).我用的是度为ng级的底物,大部分western都还可以,pg级的还放在手里,没舍得用.
*注7 高背景原因是因为HRP偶联二抗结合到膜上,其原因包过直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗(主要指多抗中的杂抗体)间接结合、通过封闭物(与封闭物交叉反应)间接结合、洗脱不彻底等原因造成的.在稀释抗体降低背景的同时也会降低对目的蛋白的结合效率,意即以信号强度为代价.不过在此提出另外一种和稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度.这种办法适用于HRP结合到膜上较多而且底物相对极其(如pg级底物,因极其可把结合到膜上的极其微量抗体产生的背景也显示出来,而这种背景在ng级底物即使压片过夜也没有显示),无论如何稀释抗体和加强洗膜都不能消除背景或者条带和背景随稀释呈等比例递减甚至条带递减速度比背景还快,如果稀释抗体则压片时间需延长而背景反而因此更加明显.这种情况下认为需要提高抗体含量以提高条带显示程度,而背景随抗体浓度提高并不加强的很厉害,如是则可以通过减少压片时间而达到突出条带降低背景的目的(我最近带一个研究生使用pg级超级底物时发现此现象并使用此方决背景高的难题,当时一抗稀释为原来的4倍,二抗稀释为原来的10倍,即总稀释为原来的40倍仍然可以看到背景的荧光但条带的荧光却减了许多导致条带和背景都无法区分了,后来回复原来浓度并稍微延长孵育时间则条带荧显盖过背景并减少压片时间至5s解决).
*注8 这一点似乎多数人都不重视,所以有时候会有些意外.我一般室温2~4h,但4度过夜确实是最好的.另外在平皿中摇似乎比封口膜更容易掌握并获得较好的效果,对新手似乎更好.
*注9 实际上牛奶对于多数抗体来说还是很好的,但所有二抗也都写着：与牛奶可能有交叉反应.BSA蛋白单一,可降低因牛奶其他成分引起的背景.单用TBST也可以,此法虽然减少了交叉,但单就封闭能力而言却也因此而降低
*注11 以度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影,对一切原因有效,但效果局限.
*注12 以度为代价其最低标准是使目的条带能够正常显影,仅对膜上蛋白和一抗引起的有效.
*注13 主要是气泡在胶-膜之间引起的绝缘区使蛋白无法通过而不能到达膜上,这一步在操作时尤其要小心,我自己犯过,也看到其他人犯过.我的办法是把胶铺到膜上,先使其一边接触膜的一边,这样就会在胶和膜交界的地方形成一个水相前缘,然后慢慢落下凝胶,这样这个水相前缘就会逐渐推进直至胶膜重合,如是则不会有气泡产生.把胶铺到膜上而非相反是因为胶是透明的,可以看到水相前缘以及有无气泡产生.
*注14 膜平衡不均或有油脂污染的表现是膜上有疏水的通明色和蛋白几无(丽春红染),这点并不多见.
*注15 这一点我是抄pierce的说明书的,我没遇到过,膜与X光片间有气泡也不影响荧光通过,这个我可以肯定.似乎不透明的东西才会导致.
*注16 非性条带在普通多抗比较多见,纯化多抗会好的多,但单抗也不是绝对没有,我也遇到过.关于wetern的抗体选择在此提出我的观点：最理想的是混合单抗,其次是纯化多抗,单抗和多抗各有局限和特点,根据个人对性需求和蛋白的稳定性而定.考虑的参数主要是抗原表位和性两个因素,不包含每个抗体价格.混合单抗虽然针对多个表位但代价太高,需购置多个单抗然后混合,很少有人这么做.纯化多抗基本具有混合多抗的性质和优点,表位多,稳定性好,性也不差,我觉得是实际中的首选.单抗虽然性好,但如果其针对的表位在提取蛋白时被则其度为会下降甚至为0,故不稳定.普通多抗虽然表位多,但因含其他抗体,性差了好多,会有很多杂带乃至背景.实际我做的抗体多数都是普通多抗,只要封闭的好,效果还是很不错的;单抗虽说不稳定,但实际中我都能做出来,尤其是内参,强烈推荐只选单抗.
*注18 主要原因是牛奶里面会有一些不悬浮的大颗粒,这些东西对封闭无益.我所有的牛奶全是配好后在4度静置(最好放在尖底的管子内),这样那些大颗粒就会沉淀到底部,吸取时不要担心牛奶不均而特意混匀,我只吸的,下面的颗粒则不要取.如是则在也没有遇到这种现象.不推荐过滤牛奶,因为耗时极长且得率极低.我用过几次但后来废弃了这种做法.
*注19 对于各个公司的抗体的稀释比例最好换算为ug/ml来应用,而且大可以不用理会说明书上的推荐抗体稀释比列,一般都是偏大的.
*注16 于2006-04-22下午稍做修改,为防止,权衡之后将抗体选择由原来的“再次是单抗,最后是普通多抗”改为单抗和多抗各有局限和特点,根据个人对性需求和蛋白的稳定性而定.尤其是内参,强烈推荐只选单抗.请战友更新
*注4 于2006-04-30上午稍做修改,为全面论,增加了每一个具体条带以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量,请战友更新
压2张片于2006-05-06上午稍做修改,增补了压取2张片子的具体做法和注意之处,请战友更新
*注7 于2006-06-16下午稍做修改,增加了一种提高抗体浓度以突出条带而降低背景的做法和相关解释,请战友更新
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