【摘要】 转基因植物作为表达药用蛋白的反应器,与传统的生产方法相比,具有许多优点,如较低的生产成本、快速规模化的生产模式、不存在对人体健康有害的病原体,同时具有折叠和正确组装复合蛋白的能力等,已成为目前植物基因工程研究热点之一,本文就不同转基因植物用于诊断、治疗及预防等药用蛋白表达的国内外研究情况作介绍.
随着现代生物技术的发展,植物基因工程的研究拓宽了植物的使用范围,不仅用于农业,而且延伸到了医药领域,特别是利用转基因植物表达药用蛋白是植物基因工程技术领域引人注目的研究热点之一.转基因植物作为表达药用蛋白的生物反应器,为人类提供了一个更加安全廉价的生产体系.与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比,它具有许多优势,例如,植物中不含有潜在的人类病原物,因而使用安全;植物来源广,生产制造简单,可以进行规模化田间种植,生产成本大幅度下降;生物活性蛋白可长期稳定地储存于植物组织或器官中,有利于蛋白的保存和运输,这一技术的研究及应用具有巨大的潜在价值.
1.1 转基因植物表达的药用蛋白 植物给人们提供了许多有用的物质,在中医制药中,植物药是不可缺少的重要组成部分,特别是近20年来,生物技术的发展使植物用于表 达异源性蛋白成为可能,这大大扩宽了植物的应用范围.1986年,第一个在转基因烟草中表达了人生长激素(human growth hormone) [1] ,研究表明,该激素与农杆菌胭脂氨酸合成酶形成融合体在烟草中得到表达.以后,相继有许多生物活性蛋白,从血液产品到细胞因子及其他信号都在不同的植物或植物细胞中表达.例如,利用烟草叶绿体系统高水平地表达人源性蛋白,人生长激素在转基因烟草叶绿体中的表达量达可溶性蛋白总量的7% [2] ;人血清白蛋白在该系统中的表达量高达11% [3] ,这无疑给高需求量的药用蛋白提供了充足的药用资源.在我国,高书颖等构建了由双35S启动子控制的人骨形成蛋白3成熟肽(hBMP-3m)基因的植物表达载体,建立了hBMP-3m烟草基因的植物表达系统 [4] .植物表达的生物活性蛋白至少有几十种,表1列出了部分药用蛋白. 表1 植物表达的药用蛋白(略)
1.2 转基因植物表达抗体 用植物生产抗体是一个巨大的挑战,因为抗体必须折叠和正确组装才能辨认相应的抗原.1989年,第1例抗体在烟草中表达 [34] ,这标志着植物不仅能表达简单蛋白,也能组装带有多个亚基的功能性糖蛋白复合体.虽然在植物表达系统中,烟草是研究最多的植物,但由于它的有毒性了转基因烟草的应用.近几年,许多抗体由谷子来生产,累积在干燥种子中的抗体可在室温下长时间储存而不失去生物活性.抗体生产的其他体系还有植物细胞悬浮培养,可在几周或数月内实现产品生产,这些研究为生产抗体奠定了商业化基础.38Cl3(scFv)已经完成I期临床试验 [35] .PIPP是识别hCG的单克隆抗体,在烟草中得到表达,获得的抗体能在leydig cell培养中的hCG而刺激睾酮的产生,还可作为诊断试剂,用于妇女早孕检测 [36] .表2为部分植物表达的抗体. 表2 转基因植物表达的抗体(略)
1.3 转基因植物表达抗原 自从乙肝疫苗(HBV)生产和试验以来,在水果叶片及种子等植物器官中表达的可食性疫苗变得越来越广泛,成为新的研究热点.借助于植物细胞壁的,植物疫苗可通过人体胃肠道而不易失去生物活性,通过与机体黏膜结合产生免疫应答.近百年来,随着科学技术的发展,人们从传统疫苗,发展到重组疫苗和基因疫苗,疫苗已成为人类目前最成功、最有效的防病手段.传统疫苗和重组疫苗虽然有效,但对生产、储存、运输使用等各方面要求严格,使用不方便、价格昂贵、对经济不发达的国家难以推广等.而经口服传递的可食用疫苗具有安全、有效、方便、价廉,不需后续纯化加工过程,容易生产、储存和运输,是目前最有开发前景的疫苗.自从1992年Mason等首次将乙肝病毒表面抗原基因转入烟草后 [47] ,近十年来,可食疫苗研究取得了巨大进展.特别是乙肝疫苗的研究进展迅速,1995年Mason等又将乙肝病毒表面抗原基因转入马铃薯,并用表达的薯块饲喂小鼠,在小鼠体内检测到性抗体 48] ,目前在马铃薯和生菜中表达的HBV已进入了临床试验阶段 [49] ,Norwalk病毒抗原也进入临床试验 [50] .在我国马英、赵绣英、陈岩红等于2002年成功地将乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因转入番茄、胡萝卜和花生中 [4] .部分在植物系统表达的疫苗列于表3 表3 植物表达的疫苗(略)
1.4 转基因植物表达其他医用相关蛋白 除了以上所述 蛋白外,一些用于保健的蛋白也在植物里得到表达.如能增进小孩健康的人奶蛋白β-酪蛋白(β-casein)、溶菌酶(lysozyme) [22,81] ,2001年Philip等在大豆中表达了牛β-酪蛋白(bovine beta-casein) [82] ,蜘蛛丝蛋白由于其显著的机械性而备受人们的关注,但不可能大量从蜘蛛获得,Scheller等人2001年用烟草和马铃薯中表达了蜘蛛丝蛋白 [83] .
2.1 烟草 烟草是生物活性蛋白表达最成功的宿主,在实验室内被广泛用于生物活性蛋白表达系统的研究,其主要的优点是具有基因转入和表达的成熟技术,能提供大量的烟草种子,具有大规模生产的可能性,目前乙肝疫苗在烟草中表达已经形成规模化生产 [84] .尽管许多烟草品种含有较高水平的有毒生物碱,可用低毒生物碱烟草品种进行生物活性蛋白的生产,或用其它培养烟草器官技术来表达活性蛋白.
2.1.1 水培烟草的根分泌物 可利用烟草根分泌物从转基因烟草中获得生物活性蛋白,例如,单克隆抗体可分泌在水培介质中,收率为每天11.7μg抗体/每克根干重 [45] ,从水培介质中容易纯化蛋白,并且植物可存活几个月,不需种植和收割,根分泌物对于生产抗体具有诱人的前景.
2.1.2 烟草叶绿体基因工程 利用粒子轰击,将目的基因插入烟草叶绿体基因组,由于光合细胞中存在大量叶绿体,叶绿体的优点是获得高水平的转基因拷贝数,无体位效应和基因沉默,蛋白可得到较高水平的表达,例如,破伤风类毒素在叶绿体中的表达率可超过水溶性蛋白的25% [85] ,用在烟草叶绿体中的表达物免疫小鼠,获得相应的抗体,显示了较好的生物活性;人生长激素和人血清白蛋白已经在烟草叶绿体中得到高水平表达,并显示生物活性 [2,3] ;霍乱毒素B亚基也能在烟草叶绿体中表达,并能正确的折叠和组装成多亚基蛋白 [62] .
2.1.3 烟草细胞悬浮培养 生物活性蛋白还可用烟草细胞悬浮培养来生产,例如、白细胞介素-2及人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)等都可由烟草细胞悬浮培养生产 [9,14,28] .
2.2 谷物及豆类 用谷物和豆类表达生物活性蛋白最大的优点是表达率高,表达蛋白可被储存于种子中,其生物活性可在室温下长时间储存而无明显变化 [46] .
2.2.1 水稻细胞悬浮培养 人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)虽然在烟草细胞悬浮培养中得到表达,但在培养介质中,由于蛋白水解酶的作用,hGM-CSF的表达量随着培养时间的延长而降低,Yun-Ji Shin等人2003年,采用水稻细胞悬浮培养,降低了培养介质中蛋白水解酶的活性,使hGM-CSF的收率得到明显提高 [14] ;α-1-抗胰蛋白酶是人体血液中存在最多的蛋白水解酶因子,是重要的药用蛋白之一,利用水稻细胞悬浮培养,可获得较好的表达率,收率可达分泌蛋白的20% [23～25] .
2.2.2 水稻、小麦植物 Stoger等人,于2000年首先将治疗癌症的抗体scFvT84.66转入小麦和水稻,在小麦和水稻的叶子和种子中得到表达,其生物活性在干种子储存5个月后无明显变化,并显示了明显的治疗效果.该研究组还建立了谷物农业用于生产高价值药用蛋白的生产系统 [46] .
2.2.3 玉米 玉米是现在用于生产药用蛋白的主要植物, Elizabeth于1997年用玉米商业化生产亲和素,获得高表达性体,常规的收割条件不影响玉米中亲和素生物活性,同时利用亲和层析手段,从玉米中获得纯度大于90%的亲和素 [31] .次年Kusnadi等也在玉米中表达了β-葡萄糖苷酸酶和亲和素,表达量是收获种子中可溶性蛋白的0.7%和5.7%,稳定性研究表明,含有β-葡萄糖苷酸酶或亲和素的玉米在10℃储存至少3个月以上,在25℃储存2周,而生物活性无明显变化.加热稳定性试验显示,两种活性蛋白在50℃可保持1个星期 [18,19] .
牛胰蛋白酶是一种广泛用于消化、治疗和其它商业用途的水解酶.重组胰蛋白酶虽可通过细胞培养、细菌和酵母等体系来生产,但至今为止,都没有形成规模化生产,牛胰蛋白酶的生产量远远满足不了生物药厂的需要.2003年,Woodard首次报道了用转基因玉米规模化水平生产牛胰蛋白酶及其产品的功能特征,研究表明,该酶具有与牛胰腺胰蛋白酶相当的活性,在医药中能作为动物来源胰蛋白酶的代替品 [26] .2.2.4 大豆 Zeitlin等人1998用大豆(soybean)表达抗单纯疱疹病毒抗体(HSV-IgG),与哺乳动物细胞培养的HSV-IgG比较,显示相同的生物活性 [37] .
2.2.6 紫花苜宿 Wigdorovitz在1999年首次报道,用紫花苜蓿成功的表达了口蹄疫病毒VP1蛋白,并用紫花苜蓿的叶子提取物和新鲜叶子饲喂小鼠,在小鼠体内产生相应的免疫反应,为植物可食性疫苗提供了实验依据 [67] ;Tuboly等人于2000年将猪可传染性肠胃炎病毒S蛋白在紫花苜蓿中表达,利用病毒中和法和酶联免疫法测定,证明在猪的体内产生相应的生物活性效应 [70] .
2.3 水果及蔬菜 水果和蔬菜作为生物活性蛋白的表达系统主要的优点是能生吃和容易种植,因而特别适合疫苗、食品添加剂和抗体的生产,例如马铃薯、番茄、生菜、葡萄、香蕉等水果,都已用来表达生物活性物质.
2.3.1 马铃薯 马铃薯已经广泛地用于植物疫苗的生产及临床应用研究.Artsaenk1998报道,他们成功地将马铃薯用于scFv抗体的生产,其重组抗体的表达率为马铃薯块茎可溶性蛋白的2%.新鲜的马铃薯在4℃储存1年半后,scFv抗体的活性没有降低.利用亲和层析可方便地纯化scFv抗体 [87] .
轮状病毒VP7是常见的小儿腹泻病毒,每年全球大约有一百万儿童死于VP7感染,用其它方法制备的VP7疫苗能在小鼠体内提高抗体水平,但不能小鼠抵抗VP7病毒的毒性,Wu等人于2003年将该病毒在马铃薯表达,获得的抗VP7病毒疫苗在小鼠体内可产生性抗VP7病毒的血清IgG和黏膜IgA,IgG的滴度为600,IgA抗体的滴度高达1000,并能中和VP7病毒的毒性 [55] .
Schünmann等于2002年首次报道用转基因土豆表达抗体融合蛋白,获得抗血型糖蛋白单链抗体与HIV病毒表位融合蛋白在马铃薯中高水平表达产物,该表达融合体的粗提物无需任何纯化即可代替SimpliRED(tm)诊断试剂,对HIV病毒进行凝聚测定 [84] .
2.3.2 番茄 番茄是第一次用于生产狂犬病疫苗的绿色蔬菜,它具有口感好、产量高等优点,McGarvey等1995年将狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein)基因成功地转入番茄,获得可食性疫苗 [64] .陈岩红等2002年将乙肝病毒表面抗原成功转入番茄 [4]
2.3.3 莴苣 莴苣也可用于生产可食用疫苗,HBV疫苗已进入临床试验,试验结果显示,三分之二的志愿者产生免疫反应 [49] .此外香蕉、葡萄也是用于生产可食用疫苗的宿主水果,其优点在于生长范围广,口感好,能生吃及食用方便等.
3.1 瞬时表达系统 利用植物病毒为载体将编码生物活性蛋白的基因或编码疫苗抗原决定簇基因插入植物病毒基因组中,再用此重组病毒感染植物,生物活性蛋白或抗原基因随病毒在植物体内复制、装配达到高效表达.将构建好的外源性基因的病毒载体导入植物主要采用的是体外接种法.目前所用的植物病毒有双链DNA花椰菜病毒CaMV),能感染十字花科和少数非十字花科(如茄科)植物;单链RNA烟草花叶病毒(TMV),是一种复制量和外壳蛋白质表达量很高的病毒,具有寄主范围广、能在整体植物上快速扩散等特点,多年来,人们一直想把TMV作为植物表达载体,建立植物细胞外源基因的表达体系,并提出了利用TMV表达外源基因的多种策略;此外还有单链DNA番茄金黄花叶双病毒(TGMV)、非州木薯花叶病毒(ACMV)、玉米线条病毒(MSV)、小麦矮缩病毒(WDV)、大麦条文花叶病毒(BSMV)、番茄丛矮病毒(TBSV)、马铃薯X病毒(PVX)、烟草蚀刻病毒(TEV)、李痘病毒(PPV)等 [88] .
3.2 稳定表达系统 利用农杆菌介导法或DNA直接转移法,把编码生物活性蛋白的外源基因或编码结构性抗原决定簇参与性免疫应答的病原体DNA导入植物细胞,并整合到植物细胞染色体上,整合了外源基因的植物细胞在一定条件长成新的植株,并在生长过程中表达生物活性蛋白和疫苗,同时把能表达异源性蛋白的性状遗传给子代,形成稳定的表达生物活性蛋白的植物品系 [88] .
植物生产体系虽具有许多优点,植物上游生产成本也 比其它系统都低,但植物生物产品的下游加工非常困难,价格昂贵,主要原因在于重组蛋白质占植物总生物量的比值较低.如何提高植物中的生物活性物的含量是人们主要研究的问题.今后发展的主要方向为:提高植物中外源蛋白表达量;改变表达策略,降低下游生产成本;减少或避免纯化过程.对于需要纯化的生物活性物,应该选用经济的纯化方法,在确定选择植物表达某种生物活性蛋白之前,这是首先考虑的问题.近年来研究表明,将植子油脂体作为蛋白质或肽类的载体,可以有效地降低下游的加工成本.例如外源蛋白水蛭素与植物结构性油脂体蛋白形成的融合蛋白已在油莱中表达,油脂蛋白的亲脂性有利于蛋白高效纯化 [15] ;Azzoni等2002年建立了玉米规模化生产人抑肽酶(human aprotinin)分离纯化体系,通过制备琼脂糖-IDA-Cu 2+ 的柱子,使人抑肽酶的纯度达到79%以上 [13] .尽管利用植物表达药用蛋白还是一个崭新的研究领域,许多问题需要研究和探索,但利用转基因植物生产药用蛋白具有十分广阔的应用前景,在不久的将来,转基因生产的药用蛋白将可能会在医药领域占有巨大的市场份额.
4. 高书颖,郭葛光,金伟波,等.利用转基因植物生产药用蛋白研究进展.西北植物学报,2003,23(6):1044-1048.
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