蛋白表达：星形细胞瘤中FHIT、PCNA蛋白表达及意义
1996年Ohta[1]等人利用外显子捕获法(exon trapping)确定并克隆出FHIT基因.该基因定位在3号染色体短臂3p14.2区域,跨越人类染色体脆性部位FRA3B,并含有编码组氨酸三联体的功能区,故命名为脆性组氨酸三联体基因(fragile histidine triad, FHIT).FHIT基因存在于大多数正常组织中,许多恶性肿瘤存在该基因异常.研究FHIT 基因在各种肿瘤组织中的改变,确认其是否为抑癌基因是近年来肿瘤学研究的热点之一.Ji等[2]发现用FHIT的腺病毒转导的肺癌细胞系有...
蛋白分离纯化：蛋白质纯化经验指南（1）
请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列,没有问题.细胞破碎后,融合蛋白在沉淀里,我用助溶剂提取后,可以用GST做亲和层析,但效率只有50～60%左右.洗脱完融合蛋白不需要助溶剂,但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀,我用0.5%CHAPS助溶可勉强溶解部分,目的蛋白疏水性比较强....
蛋白表达：去Tag不留痕――NEB原核表达系列
融合表达在最初的鉴定和纯化时有标签会方便许多,但是融合表达的问题是最终如何去掉外源的融合标签,特别是有可能用于医疗用途的蛋白质,往往必需去掉所有外源的氨基酸.可是在最后要除掉它的时候就会带来许多麻烦――比如要在25度用蛋白酶切割10多个小时容易引起目的蛋白变性、切割后的蛋白酶污染问题,以及目标蛋白会有残留氨基酸.为了解决这个问题,通用医疗(原安玛西亚)有在5℃下进行切割的蛋白酶,Qiagen也有4℃下进行切割的蛋白酶,这样可以最大程度地防止蛋白降解.同时Qiagen还通过基因让蛋白酶也带上标签,这样一...
蛋白分离纯化：蛋白质纯化经验指南（7）
你有个贴子中说在纯化过程中上样的样品中pH和盐浓度,以及种类等组分一定要平衡缓冲液完全相同至少相当.我想试试你说的硫酸铵沉淀后直接过疏水柱,那我是不是要先确定复溶后样品的盐浓度再确定平衡缓冲液的盐浓度啊,如果是我怎么检测样品的盐浓度啊...
Western-blot：Western实验步骤
贴壁和悬浮细胞收集方式不同,细胞裂解液种类各异,推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解,煮沸即可....
蛋白分离纯化：蛋白质纯化经验指南（3）
30%-60%硫酸铵沉淀可能对你的目的蛋白来讲,太粗略了,如你所言,目的蛋白可能在沉淀中,可否分级沉淀,30%-50%,50%-60%,再测一下活性可能就分开了,20mg/ml的蛋白浓度对于层析是有点高,洗脱液浓度变化或PH的改变都会使蛋白失,最好不要超过10mg/ml....
基础知识：色谱基础知识
1.利用混合物中各组分在流动相和固定相中具有不同的溶解和解吸能力,或不同的吸脱附能力或其他亲和性能作用的差异....
基础知识：蛋白质立体结构原则
1.由于C=O双键中的π电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”,使肽键具有部分双键的性质,不能旋转. 2.与肽键相连的六个原子构成刚性平面结构,称...
SDS-PAGE：SDS-PAGE常用参数
(a为单体丙烯酰胺的克数,b为N-N’-甲叉双丙烯酰胺的克数,m为缓冲液终体积)...
Western-blot：关于WB的小知识
又名Xylene brilliant cyaninG.比考马斯亮蓝R250多二个甲基.MW=854;λmax=590―610nm.染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍.优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色.所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析....
蛋白表达：含多个磷酸化位点的多肽的合成
磷酸化多肽(主要指肽链中的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的侧链羟基被磷酸化生成酸式磷酸酯的修饰多肽)是研究蛋白质磷酸化过程的必不可少的工具，它可作为磷酸酶模型底物，或作为可产生抗磷酸化蛋白抗体的抗原，也可以在确定磷酸化蛋白的物理参数时作为参考化合物等[3]。因此磷酸化多肽的合成在过去的几年中吸引了相当大的兴趣，目前已确定了较为成熟的合成线，使磷酸化多肽的合成趋于常规。目前磷酸化多肽的合成主要有两个策略：后磷酸化法(Global phosphorylation)和单体法(Building block appro...
蛋白表达：腺病毒系统重组技术
1. 提高了病毒的滴度.一次大规模扩增,纯化得到的病毒量可以满足上百只裸鼠实验或几十只大鼠实验....
蛋白提取：酪蛋白的提取
酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零,同种电荷间的作用消失,溶解度很低,利用这一性质,经牛乳调到pH4.6,酪蛋白就从牛乳中分离出来.酪蛋白不溶于乙醇,这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去....
蛋白分离纯化：蛋白纯化常见问题
2) 请问有没有合成过配体为FMN的亲和胶? 亲和的填料合成过20来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是FAD有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,你是不是考虑把FAD连上去.当然FMN的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或别的活化的介质都不大好,因此我觉得这个没有什么问题. 此外如果是以FMN为辅酶的,那我还可以你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶.如果它可以你就不需要合成填料了,有...
蛋白分离纯化：现代生物分离技术在多肽蛋白质纯化中的应用
被分离对象——蛋白质等在40～50℃便不稳定,开始变性,而且绝大多数蛋白质都不溶于有机溶剂,若使蛋白质与有机溶剂接触,也会引起蛋白质的变性....