内含: ⑴ 裂解液1 ⑵ 裂解液2 ⑶ 消化液 ⑷ 纯化液 ⑸ 弥散液 ⑹ 蛋白酶K ⑺ 带钩细玻棒一盒 ⑻ 微型滤柱若干.
取 1ml 全血,血桨,血清,淋巴细胞放入到 1.5ml 的离心管中,加入 400ul 裂解液 1.上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放入离心机中离心,离心速率为 8000rpm,1min..倒掉上层液,可见离心管底部有血色沉淀.重复此裂解步骤一次,这次是加入 1ml 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上层液弃去,以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液 1.
在离心管中加入 1ml 裂解液 2.上下翻转,务必使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放入离心机中离心,8000rpm,1 min..倒掉上清液,可见离心管底部有微量淡红色沉淀.重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入 1ml 裂解液 2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液 2.
吸取蛋白酶 K 10ul(= 0.2mg)加入到的离心管中,用移液管尖头反复吹打,使蛋白酶 K 与沉淀物均匀接触后,加入 320ul 消化液,上下翻转离心管,务必使沉淀物分散于消化液中.放入 58℃ 水浴中消化 15 分钟.最后可见澄明的消化液体.
在的消化液体中加入 110ul 纯化液,上下翻转离心管几下后,离心,速率为 15000rpm,1min,把上清液 吸出放入到装有 1000ul 无水乙醇的 1.5ml 离心管中,轻轻上下翻转 10 次,可见絮状 DNA 析出.用带钩的玻璃棒絮状 DNA 放入到 100ul 70% 乙醇中耒回漂洗 20 次,钩出 DNA,在空气中凉干一下后放入到 100ul 弥散液中.把 DNA 弥散液保存于 4℃,过夜,使之充分弥散后 使用.提取完毕.
如要立即用此 DNA 做 PCR 实验,把 DNA 弥散液放在 58 ℃ 水浴中,保温 30 分钟,用手指拍打离心管子,使 DNA 弥散后使用.提取完毕 ⑸ 收集:
(在 DNA 极少量,不能用带钩玻璃棒的情况下)把有絮状 DNA 的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中,滤器放入离心机内,离心:8000rpm,1 min..DNA 便附着在滤漠上,弃去滤液,把滤柱放回收集管上.
附:如从 2ml 全血中提出取 DNA,方法和步骤与从 1ml 全血一样,只是在步骤 ⑷ 纯化之前,把两个 1ml 全血的消化液管内容物合并后,加入 220ul 纯化液,上下翻转离心管几下后,离心,速率为 15000rpm,1min,把上清液吸出放入到装有 1800ul 无水乙醇的 2ml 管中,轻轻上下翻转10 次,可见絮状 DNA 析出.用带钩的玻璃棒絮状 DNA 放入到 200ul 70% 乙醇中耒回漂洗 20 次,钩出 DNA,在空气中凉干一下后放入到 100ul 弥散液中.把 DNA 弥散液保存于 4 C,过夜,使之充分弥散后使用.提取完毕.
如要立即用此 DNA 做 PCR 实验,把 DNA 弥散液放在 58 ℃ 水浴中,保温 30 分钟,用手指拍打离心管子,使 DNA 弥散后使用.提取完毕
取 200ul 全血,血桨,血清或淋巴细胞放入到 1.5ml 的离心管中,加入 200ul 的裂解液 1.上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放 入离心机中离心,离心速率为 14000rpm,1 min..倒掉上层液,可见离心管底部有微量沉淀.重复此裂解步骤一次,这次也是加 200ul 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 1.
在离心管中加入 200ul 的裂解液 2.上下翻转,务必使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放入离心机中离心,14000rpm,1 min..倒掉上清液,重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入 200ul 裂解液 2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 2.
吸取蛋白酶 K 5ul(= 0.1mg)加入到的离心管中,用移液管尖头反复吹打,使蛋白酶 K 与沉淀物均匀接触后,加入 85ul 消化液,上下翻转离心管,务必使沉淀物分散于消化液中.放入到 58℃ 水浴中消化 15 分钟.最后可见澄明的消化液体.
在的消化液体中加入 30ul 纯化液,上下翻转离心管几下后,离心,速率为 14000rpm,1min,把上清液吸出放入到装有 240ul 无水乙醇的 1.5ml 离心管中,轻轻上下翻转 10 次,可见溶液稍有混浊就是絮状 DNA 析出.
把有絮状 DNA 的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中,滤器放入离心机内离心,离心速率 8000rpm,1 min..DNA 便附着在滤漠上,弃去滤液,把柱滤器放回收集管上.
⑺ 回 收 DNA:把附着 DNA 的滤柱放入一个干净的 1.5ml 离心管中.吸取 50ul 已温热到 58 C 的弥散液,轻轻放入滤膜的表面,滤器在水浴 58℃ 保温 10 分钟.离心 8000rpm,1 min.,DNA 弥散液便滤入到干净的 1.5ml 离心管内.此 DNA 弥散液可即时作 PCR 实验用.提取完毕.附:从100ul全血或体液中提取基因组DNA
取 100ul 全血,血桨,血清或淋巴细胞放入到 1.5ml 的离心管中,加入 100ul 的裂解液 1.上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放 入离心机中离心,离心速率为 14000rpm,1 min..倒掉上层液,可见离心管底部有微量沉淀.重复此裂解步骤一次,这次也是加 100ul 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 1.
在离心管中加入 100ul 的裂解液 2.上 下翻转,务必使沉淀物分散,旋转脉动 15 秒后放入离心机中离心,14000rpm,1 min..倒掉上清液,重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入 100ul 裂解液 2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 2.
吸取蛋白酶 K 5ul(= 0.1mg)加入到的离心管中,用移液管尖头反复吹打,使蛋白酶 K 与沉淀物均匀接触后,加入 60ul 消化液,上下翻转离心管,务必使沉淀物分散于消化液中.放入到 58℃ 水浴中消化 15 分钟.最后可见澄明的消化液体.
在的消化液体中加入 20ul 纯化液,上下翻转离心管几下后,离心,速率为 14000rpm,1min,把上清液吸出放入到装有 160ul 无水乙醇的 1.5ml 离心管中,轻轻上下翻转 10 次,可见溶液稍有混浊就是絮状 DNA 析出.
把有絮状 DNA 的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中,滤器放入离心机内离心,离心速率 8000rpm,1 min..DNA 便附着在滤漠上,弃去滤液,把柱滤器放回收集管上.
把附着 DNA 的滤柱放入一个干净的 1.5ml 离心管中.吸取 50ul 已温热到 58℃ 的弥散液,轻轻放入滤膜的表面,滤器在水浴 58℃ 保温 10 分钟.离心 8000rpm,1 min.,DNA 弥散液便滤入到干净的 1.5ml 离心管内.此 DNA 弥散液可即时作 PCR 实验 用.提取完毕.
取 10ml 抗凝的全血放入到 50ml 的离心管中,加入 10ml 裂解液 1.上下翻转,使沉淀物分散,在振摇机中振摇 10 分钟,放入离心机中离 心,离心速率为 2200rpm,10min..可见离心管底部有血色沉淀.倒掉上层液,重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入 10ml 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液 1.
在离心管中加入 10ml 裂解液 2.在振摇机中振摇 10 分钟,务必使沉淀物分散,放入离心机中离心,离心速率为 2200rpm,10 min..可见离心管底部有少量灰色沉 淀.倒掉上层液,留下沉淀..重复此提取步骤一次,这次仍然是加入 10ml 裂解液 2.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的灰白色沉 淀不再残留有裂解液 2.⑶ 消化:
吸取蛋白酶 K 100ul(= 2mg)加入到的离心管中,用移液管尖头反复吹打,使蛋白酶 K 与沉淀物均匀接触后,加入 1.6ml 消化液,振摇 3 分钟,放入 58℃ 水浴中消化 1 小时.消化其间,要取出离心管用手拍打一下,帮助内容物均匀消化.最后可见澄明的消化液体.
在的消化液体中加入 600ul 纯化液,混匀后,离心,速率为 2800rpm,15min,把 上清液吸出放入到装有 5ml 无水乙醇的带盖的管中,轻轻上下翻转 10 次,可见絮状 DNA 析出.用带钩的玻璃棒絮状 DNA 放入到 1000ul 的 70% 乙醇中耒回漂洗 20 次,钩出 DNA,在空气中凉干一下后放入到 500ul 弥散液中.把 DNA 弥散液保存于 4 ℃,过夜,使之充分弥散.提取完 毕.
如要立即用此 DNA 做 PCR 实验,把 DNA 弥散液放在 58℃ 水浴中,保温 30 分钟,用手指拍打离心管子,使 DNA 弥散后使用.提取完毕.
吸取 600ul PBS 到 1.5ml 离心管中,剪入刮颊刷.旋转脉动 15 秒.加入 400ul 裂解液 1.旋转脉动 15 秒后放入离心机中离 心,8000rpm,1 min..倒掉上层液.重复此提取步骤一次,这次是加入 1000ul 裂解液 1.最后用移液管吸净所有上清液弃去,以 使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 1.
在离心管中加入 1000ul 裂解液 2.旋转脉动 15 次后放入离心机中离 心,8000rpm,1 min..可见离心管底部有微量沉淀.倒掉上层清液.重复此裂解步骤一次,这次仍是加入 1000ul 裂解液 2.最后 用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液 2.刮刷留在离心管内.
吸取 20ul 蛋白酶液(= 0.4mg)加入到的离心管中,旋转脉动一下,再加入 160ul 消化液,又旋转脉动一下后,放入 58℃ 水浴中消化 15 分钟.取出后 可见的消化液.离心 8000rpm,20 秒,把盖上的液滴回落到管中.然后轻轻取出刮刷去掉.
加入 60ul 纯化液到离心管中,旋转脉动一下,放入离心机中离心,15000rpm,1min.把上清液吸出放入到 240ul 无水乙醇中 轻轻上下翻转 10 次,可见云状 DNA 析出,并浮于液面..
把上液倒入微型过滤器中,滤器放入离心机内 离心:8000rpm,1min..DNA 便附着在滤漠上.弃去收集管中的滤液.
把附着 DNA 的滤柱放在一个干净的 1.5ml 离心管中.吸取 100ul 弥散液轻轻放入滤膜的表面(弥散液事先要温热到 58℃,弥散 效果更好),静置 10 分钟.离心 8000rpm,1 min.含 DNA 的弥散液便滤入到干净的 1.5ml 离心管中.提取完毕.
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