基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交 ( 包括RFLP) 及PCR分离基因等.利用 基因组DNA较长的特性 , 可以将其与细胞器或质粒等小DNA分离.加入一定量的异丙醇或乙醇, 基因组的大DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出,而小DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的.在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以得到较长的DNA.一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少.而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可酶切后产生RFLP片段 (20kb以下),并可包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下).
不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异.在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大.尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质.
本实验以水稻幼苗(禾本科) 、李(苹果) 叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法.
移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒.
5 、其它试剂：液氮、异丙醇、TE 缓冲液,无水乙醇、70% 乙醇、3mol/L NaAc .
2、水稻幼苗或叶子 5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动.
3、加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀).
5、仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀.
7、如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中.这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解.
6、取上清液于新离心管,用等体积酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)抽提.待分层后,3000rpm离心5分钟.
9、加1/10体积 3mol/L NaAc,及2倍体积无水乙醇混合沉淀DNA.室温下静止10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物.
10、用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中 ,-20℃保存.
5、用等体积酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管.
上述方法得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP 、PCR等分析.由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果.所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量.
如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小DNA多,影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：
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