细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至200kb以上不等.各种质粒都是存在于细胞质中、于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞传递到后代.
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体,重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA.目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,本实验采用碱裂解法提取质粒DNA.
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,其基本原理为:当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来.
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质.例如,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法,但这些方法相对昂贵或费时.对于小量制备的质粒DNA,经过苯酚、氯仿抽提,RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除蛋白质和RNA,所得纯化的质粒DNA已可满足细菌、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求,故在生物学实验室中常用.
11、1% 琼脂糖凝胶:称取1g琼脂糖于三角烧瓶中,加100ml 0.5×TBE,微波炉加热至完全溶化,冷却至60℃左右,加EB母液(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml(注意:EB为强诱变剂,操作时带手套),轻轻摇匀.缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(电泳缓冲液0.5×TBE),即可上样.
1、挑取LB固体培养基上生长的单菌落,接种于2.0ml LB(含相应抗生素)液体培养基中,37℃、250g振荡培养过夜(约12-14hr).
2、取1.5ml培养物入微量离心管中,室温离心8000g×1min,弃上清,将离心管倒置,使液体尽可能流尽.
4、加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,数次混匀(不要剧烈振荡),并将离心管放置于冰上2-3min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐渐变清).
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,将管温和数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置3-5min.溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒DNA复性,染色体和蛋白质不可逆变性,形成不可溶复合物,同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀.
7、小心移出上清于一新微量离心管中,加入2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置2-5min,4℃离心12000g×15min.
8、1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次,4℃离心8000g×7min,弃上清,将沉淀在室温下晾干.
本裂解法小量制备质粒 DNA重复性好,一般无麻烦.若所提取质粒 DNA不能被性内切酶切割,可通过酚/氯仿再次抽提,以清除杂质来解决问题.
观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色.该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团,这个基团的固定及其与碱基的密切接近,导致染料与DNA结合并呈现荧光,其荧光产率比游离染料溶液有所增加.DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收.这两种情况下,被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来.因此,当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA.
取制备的质粒DNA 1-2μl,加适当loading buffer混匀上样,采用 1-5V/cm的电压,使DNA从负极向正极移动至合适,取出凝胶置紫外灯下检测,摄片.
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