大多数常用质粒都含有可被不同内切酶识别的多克隆位点.由于可供选择的克隆位点很多,因此一般来说总是能找到一个带有与某一特定外源定向克隆通常需要质粒和目的 DNA 片段两端的酶切位点不相匹配.但在某些情况下,即使当质粒和目的DNA 的片段的序列完全相同时定向克隆也能够实现.例如, Bam H1 和 Bgl Ⅱ识别的不同的六核苷酸片段（分别是 G’GATCC 和 A’GATCT ）,但所产生的酶切片段具有相同的 3’ 凸出末端.假如有一个含有 Bam H1 和 Bgl Ⅱ酶切位点的 DNA 片段被连到用这两个酶消化的质粒中,那么 DNA 片段是被双向插入的.但是将其中一个酶加入到连接反应混合物中,或者在之前用一个酶消化连接话参悟,这样就只有 Bam H1 末端和 Bgl Ⅱ末端（反之亦然）的连接产物（这样的连接实际 Bam H1 或 Bgl Ⅱ的识别序列）能够在形成重组体.这种策略的依据是闭合的环状 DNA 大肠杆菌的效率要远远高于线状 DNA .对此方法加以乙锭的变换也可以用来提高平末端 DNA 的克隆效率.偶尔,也会遇到无法找到在质粒载体和目的 DNA 之间符合定向克隆的酶切位点,对此也有一些解决方法：Klenow 片段的酶反应,部分地加以填平,如第 9 章所述,这一方法通常可使原本与某些酶切位点不相匹配变成匹配,以便质粒与外源 DNA 连接.由于部分填平减少相同相互匹配连接的机会,因此也降低了连接反应中环化合形成聚合物的频率.记住,毫摩尔浓度的 dATP 可 T4 噬菌体 DNA 连接酶.因此,如在部分填应中使用 dATP ,那么填平后的 DNA 产物应用离心柱纯化,或在乙酸铵存在的条件下进行两轮乙醇沉淀,以除去未参加反应的 Datp.本方案介绍的是克隆带有凸出末端 DNA 片段的标准方法.方案 18 将提供通过向凸出末端连接 DNA 接头以引入特定酶切位点的方法.有一定难度的平末端 DNA 片段的克隆方法将在方案
旋转柱层析装置 ，温度可调 16 ℃的水浴装置方法1、用两种适当的性内切核酸酶消化载体（ 10ug ）和外源 DNA 片段.为进行直接克隆,用两种性内切酶消化闭合环状的质粒载体,这样可以识别不同的序列以及产生不同的末端.无论哪段序列,我们应尽可能避免选用在多克隆位点上相距 12 个碱基以内的酶切位点,如果有一个酶切位点被切开,那么第二个酶切位点将离线状 DNA 的末端很近而影响第二个酶的酶切效率 .阅读生产厂家的说明以确定两种酶是否可在同样的缓冲液中工作.如果可以,就能用两种酶同时对质粒 DNA 进行消化.如果两种酶用不同的缓冲液,最好让消化反应分开进行 .此时,应首先使用适于低盐浓度的酶.在第一个酶的反应完成后,取少量消化产物通过电泳来确定是否所有的质粒 DNA 已从环状变为线形.然后适当调整缓冲液的盐浓度,再加入第二个酶.2、苯酚：氯仿抽提及乙醇沉淀纯化被消化的外源 DNA 片段.根据实验情况,我们可以参照第 5 章中描述的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳技术从外源 DNA 消化产物中分离出目的片段.当外源 DNA 片段制备物中含有能与载体连接的多个酶酶切片段时,一般需要做这种纯化.许多研究者在连接反应前,常利用琼脂糖凝胶电泳来提高外源目的 DNA 序列的纯度,而不是大量筛选子以获得所需的克隆.3、离心柱层析加常规乙醇沉淀纯化载体 DNA这一纯化步骤可以从质粒制备物中除去那些由多克隆位点中两个靠近的酶位点经酶消化后所产生的小片段 DNA .4、用 TE(PH8.0) 重新溶解纯化出的两份 DNA 沉淀,使终浓度约为 100ug/ml .假设 1bp 相当于 660Da ,计算 DNA 的浓度（ pmol/ml ） . 琼脂糖凝胶电泳检查两份 DNA 样品的大概浓度.5、 按下列表格将适量的 DNA 转移至 0.5ml 的无菌微量离心管中：管号 DNAA 和 D 载体 [30fmol(-100ng)]B 外源插入片段 [30fmol(-100ng)]C 和 E 载体（ 30fmol ）和外源插入片段（ 30fmol ）F 环状载体 [3fmol(-100ng)]a.A 、 B 和 C 管中加入：10* 连接缓冲液 1.0ulT4 连接酶 0.1Weiss 单位10mmol/L ATP 1.0ulH2O 补至 10ulb.D 和 E 管中加入：10* 连接缓冲液 1.0ul10mmol/L ATP 1.0ulH2O 补至 10ul无 DNA 连接酶在制备 DNA 片段的过程中,可以将 DNA 片段与水一起加入管中于 15 ℃温育 5min ,以消除重新复性而导致的末端相互聚合.在连接反应试剂加入之前,可将 DNA 溶液与 0 ℃预冷.为获得最大效率的连接,反应体系越小越好,一般为 5-10ul .在反应混合物中, ATP 如作为 10* 连接缓冲液的组分,可给载体和外源 DNA 插入片段的体积提供了更大的空间.有些厂家的连接缓冲液中包含有 ATP ,这样在应用时就不必另加 ATP 了.6. 连接反应混合物置于 16 ℃过夜或 20 ℃ 4h .7、按方案 23 、 24 、 25 和 26 介绍的方法,用稀释的连接产物感受态大肠杆菌.时,应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒 DNA 作为队长,以检查效率.
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