质粒拷贝数是指在正常生长条件下,每个细菌细胞或每条染色体所对应的平均质粒数.在质粒复制子的调控下,质粒拷贝数可随细菌培养条件的变化在一个较窄的范围内波动.生长条件恒定时,质粒增殖的速度与宿主细胞增殖的速度完全一致,拷贝数保持不变.
无论是质粒,还是其复制子,均能通过合理分配提供影响质粒 DNA 合成起始效率的而维持其自身的复制与宿主增殖速率的协调.在携带 p MB1/colE 复制子的质粒中,这种正向调节式一种 RNA, 被称为 RNA Ⅱ,它被永固走引发 DNA 前导链的其实合成.但是,其他复制子(如 p SC101 )的调节则是一种顺式作用蛋白( RepA ) , 它对复制的起始具有正向作用,而对其自身基因的具有负调控作用.在任何情况下,正向调控的 RNA 和蛋白质的合成和活性都受到辅助性的反式作用产物的调节,后者的浓度随质粒拷贝数或宿主菌的生理状态的变化而变化.
以 RNA 为其正向调控的质粒通常具有高拷贝数,其复制不需任何质粒编码的蛋白质.相反,他们完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质,包括伴侣、 DNA 聚合酶 I 和Ⅲ、 DNA 依赖的 RNA 聚合酶、核糖核苷酸酶 H ( Rnase H )、 DNA 促旋酶和拓扑异构酶 I .这些质粒以所谓的“松弛”方式进行复制,即使在蛋白质的合成因氨基酸饥饿或添加抗生素如氯霉素而受到印制时,质粒复制仍不停止.由于蛋白质的合成为宿主 DNA 每轮合成的其实所必需,而非质粒复制所必需,因此经氯霉素处理的细胞中质粒 DNA 的浓度相对于染色体 DNA 的量会有所增加.经过几个小时的扩增,细胞中可能累积数千拷贝的松弛型质粒,最后质粒 DNA 可占细胞 DNA 总理的 50% 甚至更多.相反地,像 Psc101 这类质粒的复制需伴随 RepA 蛋白的合成,因此一旦细胞蛋白质合成受阻,其拷贝数或产量均不能增加.这样的质粒被称为在“严紧”控制下复制的质粒.
引物发生于含有复制所必需的所有顺式作用元件的 600 个核苷酸的区段. DNA 前导链的合成以 RNA Ⅱ为引物.
RNA Ⅱ前体的合成起始于其复制起点上游 500bp 处得启动子区,继而穿过复制起点,终止于下游大约 150 个核苷酸附近的一个位点.此约 750 个核苷酸的起始物的 5’ 端折叠成复杂的二级结构,从而使 RNA Ⅱ产生一个富 G 环,后者与位于模板链复制起点上游 20 个核苷酸处的质粒 DNA 富 C 区正好匹配.随后,该 RNA Ⅱ产物由 RnaseH 加工为成熟引物,其切割位点位于复制起点内 5 个 A 徐类中.所得的 555 个核苷酸的成熟 RNA Ⅱ被 DNA 聚合酶 I 用作引物启动前导链的合成. DNA-RNA 稳定杂交体的延伸,了 DNA 互补链上某些位点,后随链的不连续合成即在此处其实.因为后随链的合成在复制起点的上游约 20 个 核苷酸处被 RNA Ⅱ的非杂交片段封闭,因此在携带 p MB1/colE 复制子的质粒中,复制过程按凯恩斯结构(或称θ结构)无定向地进行.
ColE1 复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性,因此,一旦 DNA 合成启动子后,便不能改变其速度或进程.故而拷贝数的控制必须在 DNA 复制启动时或启动前进行.质粒 DNA 的合成依赖于复制起点处稳定的 DNA-RNA Ⅱ杂交体 的形成.正常情况下,复制的起始是由正确折叠与不当折叠的 RNA Ⅱ间相互的平衡来控制的,前者可形成稳定的杂合体,后者则不能.
这一平衡的改变主要由 RNA I 来控制, RNA I 是由 RNA Ⅱ基因的反义链编码的 108 个碱基小物.它折叠成可与新生 RNA Ⅱ前体结合的三叶草结构,从而后者折叠成形成稳定杂交体所必需的二级结构.
RNA I 与 RNA Ⅱ相互作用的机制曾由 Tomizawa 及其同事做过详细的阐述.当新生 RNA Ⅱ物的长度在 80-360 个核苷酸之间时,其折叠特别容易受到 RNAI 的干扰.结合首次发生于这两个 RNA 的茎环结构,导致 RNA Ⅱ的 5’ 区与全程 RNA I 此乃过程一段双链 RNA .因此, RNA I 昨晚质粒 DNA 合成起始的负调节物控制质粒拷贝数.
解释维持质粒拷贝数的最简单是胞质内 RNA I 的稳态浓度时由基因剂量决定的.如果质粒的拷贝数高于正常值, RNA I 的浓度便上升,质粒 DNA 的复制受.不过只有 RNA I 的半衰期较短和 RNA I 得降解速度与细菌的生长速率成比例是,质粒拷贝数与印制剂浓度波动之间的这种关联才能发生.在细胞的正常生长条件下,这两种情况似乎都会发生,此时 RNA I 的半衰期为 1-2min .动力学计算显示这一时期足够短,以致该可以作为质粒拷贝数的实时监测器.
RNA I 的降解过程分为两个阶段.首先,由 RnaseE 将其 5’ 端得 5 个核苷酸切除,所形成的截短仍能与 RNA Ⅱ结合,但易被一种核糖核酸酶,该酶的活性对生长速度.这种调节提供了维持恒定质粒拷贝数的机制,即使在细胞呈间歇式生长时亦不例外.
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